小分子量蛋白成功做好WB實(shí)驗(yàn)的影響因素

 

通常Western Blot每孔上樣量為30-50μg，80%蛋白在細(xì)胞中的含量很低，當(dāng)?shù)鞍追肿恿窟^(guò)小時(shí)，上樣量建議選擇50-100μg。畢竟對(duì) 于小分子的蛋白來(lái)說(shuō)，在跑電泳時(shí)，稍不留心，蛋白就跑沒(méi)影了。

 

1.選擇合適膠濃度。分子量小的蛋白，建議配置5%的濃縮膠，分離膠濃度參考下表。

分子量（kDa)	分離膠濃度
X≤10	15%
10	13.5%
15	12%

2.電泳電壓太大會(huì)導(dǎo)致跑在最前面的小分子蛋白成鋸齒狀，建議濃縮膠用80V 30分鐘，之后調(diào)成100V, 溴酚藍(lán)跑到距膠底1cm以上就停下，不要跑到底，否則目的蛋白可能跑出去了。

 

1.膜的選擇。免疫印跡中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF 膜等。推薦選用 PVDF 膜（聚偏二氟乙烯），因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與 PVDF 膜以疏水力結(jié)合，從而將親水部位暴露到液相，使抗體更容易與之結(jié)合。

 

針對(duì)不同分子量的蛋白質(zhì)，PVDF 膜有兩種規(guī)格：0.45 μm 的膜適合檢測(cè) MW ＞ 20 kDa 的蛋白質(zhì)，0.2 μm 的膜適合檢測(cè)MW ＜ 20 kDa 的蛋白質(zhì)，而且0.2 μm 的膜可以有效防止蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移過(guò)程中直接穿透過(guò)膜。PVDF 膜使用之前需要在甲醇中浸泡 5min 后再轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中，PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。

 

2.轉(zhuǎn)膜方式。對(duì)于小分子蛋白，電流太大或時(shí)間太長(zhǎng)容易轉(zhuǎn)過(guò)。轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)，條件參考下圖

 

PVDF膜經(jīng)麗春紅染色后，可以檢測(cè)出樣品電泳過(guò)程中呈現(xiàn)印跡的大小，通過(guò)各個(gè)泳道上樣品印跡的對(duì)比，可以初步判斷上樣量的準(zhǔn)確性。

 

通常抗體的說(shuō)明書(shū)上都會(huì)給出一定的稀釋比例對(duì)于分子量過(guò)小的蛋白來(lái)說(shuō)，一抗應(yīng)選擇低的稀釋比例，這樣有助于抗體的結(jié)合。