Genizer微射流高壓均質(zhì)機應用于Rob蛋白提取

近日，名為“Structural basis of transcription activation by Rob, a pleiotropic AraC/XylS family regulator”的研究文章見刊于Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue 10, 10 June 2022, Pages 5974–5987，期刊IF=16.971，作者單位為南京中醫(yī)藥大學、中國科學院微生物研究所等。Genizer微射流高壓均質(zhì)機應用于Rob蛋白的提取過程。

圖 耐藥菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rob作用機制研究見刊Nucleic Acids Research

抗生素的濫用導致越來越多的細菌耐藥性產(chǎn)生，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rob 是一種典型的細菌AraC家族轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)節(jié)涉及多種藥物耐藥性和應激反應的不同基因亞群。然而，它如何使細菌 RNA 聚合酶和啟動子 DNA 對環(huán)境刺激做出精細反應的潛在機制仍然未知。

本研究通過解析轉(zhuǎn)錄因子Rob的相關復合物結構，為Rob調(diào)節(jié)耐藥基因激活的分子機制提供了詳細的原理依據(jù)，揭示了一種耐藥菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，同時為耐藥菌新藥靶點發(fā)現(xiàn)提供了依據(jù)。

圖 轉(zhuǎn)錄因子Rob調(diào)控機制示意圖

本研究中首次獲得兩種依賴于 Rob 的轉(zhuǎn)錄激活復合物 (Rob-TAC) 的冷凍電鏡結構，包括大腸桿菌RNA 聚合酶 (RNAP)、Rob 調(diào)節(jié)的啟動子和具有替代構象的 Rob。這些結構表明，研究證明 Rob與 RNA聚合酶的C末端結構域、σ70R4結構域同時發(fā)生相互作用，闡明了此類作用力在細菌轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控中的重要意義。除阻礙RNA聚合酶σ70R4結構域結合啟動子的-35元件外，酸性環(huán)（acidic loop）可輔助穩(wěn)定Rob NTD與保守rob結合元件間的特異性相互作用。另外，配體對接和生化實驗分析表明，Rob CTD與普遍存在的Gyrl樣結構域具有高度結構相似性，可通過識別結合配體發(fā)生“別構調(diào)節(jié)”功能，進而促進Rob-TAC的形成。該研究的結構和生化數(shù)據(jù)首次揭示了 Rob 依賴性轉(zhuǎn)錄激活的詳細分子機制，并為理解其他 AraC/XylS 家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用機制提供了有利的證據(jù)。

圖 耐藥菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rob作用機制研究文章摘要

圖 大腸桿菌Rob的轉(zhuǎn)錄激活復合物 (Rob-TAC) 結構示意圖

在Rob蛋白的純化過程中，Genizer微射流高壓均質(zhì)機應用于蛋白的釋放，Genizer微射流高壓均質(zhì)機通過高效物理作用裂解工程菌種，快速高效釋放表達蛋白的同時，高度模塊化的作用模塊設計+物料換熱器緊挨金剛石交互容腔出口的設計，使得Genizer微射流高壓均質(zhì)機能夠快速裂解工程菌細胞，同時使得裂解混合物能夠快速進入物料換熱器進行降溫，極大的保存了蛋白原有構象和活性。在高活性蛋白等物質(zhì)提取過程中Genizer微射流高壓均質(zhì)機具有獨特優(yōu)勢。

圖 Genizer微射流高壓均質(zhì)機應用于Rob蛋白提取