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監(jiān)測實時分析在Cell首次揭秘溶酶體氫離子通道的應用

瀏覽次數(shù)：936　發(fā)布日期：2022-7-13　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

北京時間2022年6月23日晚23時，在發(fā)表于Cell雜志的一項研究中，美國密歇根大學安娜堡分校徐浩新（Haoxing Xu）團隊鑒定出首個溶酶體膜上的氫離子通道TMEM175，并發(fā)現(xiàn)TMEM175在調控溶酶體酸堿平衡的重要作用——處于激活狀態(tài)的TMEM175能夠介導過量的氫離子溢出溶酶體，從而避免溶酶體內部處于過酸性狀態(tài)。

徐浩新教授和胡美欽博士為論文共同通訊作者，胡美欽博士、李平博士和王策博士為共同第一作者

作為細胞中的“回收站”，溶酶體在細胞健康代謝中發(fā)揮著重要作用。而溶酶體內部偏酸性的pH環(huán)境（pH~4.6），又是保障溶酶體持續(xù)正常運轉的基礎。那么溶酶體內部pH的穩(wěn)態(tài)究竟是如何維持的呢？質子泵V-ATPase自然居功至偉。此前，V-ATPase復合物已經被發(fā)現(xiàn)可以通過一系列精妙的調節(jié)機制，實現(xiàn)對溶酶體內外pH穩(wěn)態(tài)的維持。這套復雜的分子機器能夠利用ATP水解產生的能量，源源不斷地將細胞質基質中的氫離子逆濃度梯度泵入溶酶體內部，從而為溶酶體營造出一片酸性的環(huán)境。除此之外，研究者們一直認為存在未被鑒定的氫離子通道來介導氫離子快速外流，并和V-ATPase協(xié)同來調節(jié)溶酶體的酸堿平衡。

這一研究的靈感來源于徐浩新教授團隊很早以前的一個發(fā)現(xiàn)：他們在對細胞內溶酶體膜直接進行電生理記錄時，只要溶酶體膜內外仿照生理條件存在pH差別（膜外為pH=7.2的中性環(huán)境，膜內為pH=4.6的酸性環(huán)境），就總是能夠記錄到特異的從膜內流向膜外的微弱電流。假如將膜內pH調整為更加酸性的3.5，這一信號會更加強烈�；谶@一觀測，作者大膽猜測介導該電流的離子通道即是科學家們苦苦追尋的溶酶體膜上的氫離子通道，與V-ATPase質子泵互相配合，一進一出，共同調節(jié)溶酶體的pH平衡。

為了找出這一“預測存在”的溶酶體氫離子通道蛋白，作者對一系列可能的溶酶體膜蛋白逐一進行過表達測試，最終，在排除了數(shù)十個蛋白后，發(fā)現(xiàn)當膜蛋白TMEM175被過量表達時，所記錄到的“氫離子電流”竟比對照組高出了20倍之多；與此同時，利用CRISPR-Cas9技術將TMEM175基因進行敲除后，即使設定溶酶體膜內pH為更酸的 3.5的情況下也記錄不到任何電流信號。這些結果表明，TMEM175就是那個介導氫離子進出溶酶體的離子通道。可經過查閱文獻卻發(fā)現(xiàn)，此前圍繞TMEM175的研究工作普遍認為這是一個鉀離子通道。那么問題來了，該如何解釋兩者之間的差異呢？

經過對比，他們注意到兩者所采用的實驗條件卻存在著一個本質的不同：先前文獻在研究TMEM175時，忽略了pH對通道功能的調節(jié)作用，進而認為TMEM175主要通透的是鉀離子；而胡美欽等人則是在將溶酶體內部pH調節(jié)為更接近生理環(huán)境的酸性的條件下開展的一系列實驗——他們確認：在此生理酸性條件下，通過TMEM175的離子主要為氫離子，而非鉀離子，經過定量計算，得出TMEM175對氫離子的通透性是鉀離子的約五萬倍。

更加令人振奮的是，他們還首次鑒定出可以激活TMEM175通道的小分子化合物DCPIB和ML 67-33。這些化合物不僅能激活通道的氫離子電流，在中性條件下也同樣可以激活鉀離子電流。此外他們還發(fā)現(xiàn)內源的脂質分子花生四烯酸（Arachidonic Acid, ArA）是TMEM175通道內源的激活劑，提示脂質信號通路很可能對TMEM175的活性存在調節(jié)作用。這些激動劑均可以特異性的激活TMEM175通道來釋放溶酶體內的氫離子（溶酶體內pH上升），所以TMEM175成為可以用來調節(jié)溶酶體酸堿度的新靶點

為了進一步探究離子通道TMEM175的調控機制，作者將溶酶體內部調整為中性pH、將溶酶體外部調整為酸性pH，發(fā)現(xiàn)此時即使空有氫離子濃度梯度，卻無法記錄到氫離子電流，表明溶酶體內部的氫離子對于TMEM175激活必要性，即TMEM175可以被氫離子本身激活。

雖然在過表達的情況下可以在部分細胞上記錄到TMEM175鉀電流，但是內源性的TMEM175卻沒有表現(xiàn)出可被記錄到的鉀電流，而激動劑DCPIB和花生四烯酸卻可以激活出明顯的鉀電流，所以TMEM175并不是如之前所認為的自然開放的鉀離子通道，而是一種新型的具備門控機制的氫離子通道，并在中性或堿性環(huán)境以及激動劑存在的條件下具備鉀離子通透能力

通過突變篩選，當TMEM175蛋白中第41個氨基酸由帶負電的的天冬氨酸突變?yōu)橹行缘谋彼幔ㄓ洖镈41A突變體）時，TMEM175完全失去了酸性條件下通透氫離子的能力，但中性條件下通透鉀離子的能力得到了保留。利用D41A突變體，可以得出結論：TMEM175的氫離子的通透性，而不是鉀離子的通透性，是調控溶酶體pH相關功能的關鍵所在。

近年來，研究者在帕金森綜合征的病人體內普遍檢測到了TMEM175基因的突變，能進一步探索TMEM175功能更為廣闊的生理學意義。

首先，在細胞水平，TMEM175基因敲除細胞內溶酶體的pH穩(wěn)態(tài)被破壞，溶酶體處于一種“酸性過強”的狀態(tài)，同時溶酶體內部的蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin D活性受到影響。其次，動物模型中，研究者構建了TMEM175基因敲除小鼠，在小鼠神經元中同樣觀察到了溶酶體酸性過強、溶酶體降解功能受損的現(xiàn)象。同時，與神經退行性疾病帕金森癥致病相關的α-Synuclein聚積現(xiàn)象在TMEM175基因敲除小鼠中也更為顯著。

綜上所述，本項研究開辟了溶酶體pH調節(jié)的新方向，首次鑒定出溶酶體膜上的氫離子通道：TMEM175是一種新型的氫離子激活的氫離子通道。未來，我們期待更多圍繞TMEM175調節(jié)機制的精彩工作，以及TMEM175在神經退行性模型中所扮演的角色！

活體化學物質實時檢測系統(tǒng)可在動物清醒狀態(tài)下實施監(jiān)測多巴胺，抗壞血酸，鉀離子，腎上腺素，硫化氫，鈣離子，過氧化氫，氧氣，PH值，鎂離子，葡萄糖，乳酸等化學物質。