百變細(xì)胞療法之CAR-NK篇：為什么CAR-NK細(xì)胞得以異軍突起

一、相關(guān)背景
在講述CAR-NK細(xì)胞的故事之前，我們先談?wù)勄靶┠昝麣飧�大的CAR-T細(xì)胞。

何為CAR-T細(xì)胞？此CAR非彼CAR（汽車），此CAR全名叫做Chimeric Antigen Receptor，譯為嵌合抗原受體，其結(jié)構(gòu)包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，胞外結(jié)構(gòu)域包含靶向識(shí)別腫瘤靶抗原的抗體單鏈可變區(qū)（VH-linker-VL，scFv）、鉸鏈區(qū)；胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域是由協(xié)同共刺激分子（CD28或者4-1BB）和CD3ζ信號(hào)結(jié)構(gòu)域組成。CAR-T細(xì)胞即為用CAR武裝的T細(xì)胞，CAR分子的scFv段能夠賦予T細(xì)胞靶向性，胞內(nèi)信號(hào)域作為T細(xì)胞的動(dòng)力引擎能夠賦予T細(xì)胞強(qiáng)勁的活化動(dòng)力。因此相比于T細(xì)胞，CAR-T細(xì)胞的戰(zhàn)斗力顯著增強(qiáng)。

CAR-T細(xì)胞作為過繼性免疫治療領(lǐng)域的明星，目前已經(jīng)有七個(gè)兄弟姐妹奔波于地球各個(gè)角落行使消滅癌細(xì)胞的重要使命。但是CAR-T細(xì)胞并非十全十美：首先它是一個(gè)高度定制化的抗癌武器，而且應(yīng)用戰(zhàn)場(chǎng)也非常局限——只能用于患者自體的治療，導(dǎo)致它的制備難度高，難以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)；其次，CAR-T細(xì)胞作為極強(qiáng)的抗癌武器，在Kill癌細(xì)胞的同時(shí)自身也會(huì)“發(fā)熱”，在戰(zhàn)場(chǎng)上出大汗（釋放大量細(xì)胞因子），造成嚴(yán)重的損害（細(xì)胞因子風(fēng)暴）；再者，CAR-T細(xì)胞是一類靶向性極高的武器，但在靶點(diǎn)選擇不合適的時(shí)候，也會(huì)誤打到非打擊目標(biāo)（正常的組織和器官），造成平民傷亡（脫靶毒性）。

為了克服CAR-T細(xì)胞的這些缺陷，目前不少研究者都在嘗試不同的方法，例如對(duì)T細(xì)胞做些小手術(shù)，敲除其表面的TCR和CD52等限制其應(yīng)用場(chǎng)景的部件（避免GVHD），實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，拓寬其應(yīng)用范圍（用于異體治療）。與此同時(shí)，一些研究者也把研究目光聚焦到了T細(xì)胞的其他兄弟姐妹身上，NK細(xì)胞就是其中最受矚目的。

二、NK細(xì)胞
NK細(xì)胞大名叫作自然殺傷細(xì)胞（Nature killer cell），是1957年發(fā)現(xiàn)的人體的固有免疫細(xì)胞，占外周單核細(xì)胞的10%左右，是抗擊外敵入侵的一重要武裝力量——在抗擊病毒感染、監(jiān)視和消滅腫瘤方面具有重要作用。NK細(xì)胞的作戰(zhàn)范圍更廣（可用于異體治療），同時(shí)其Kill外敵時(shí)不需要像T細(xì)胞一樣做繁瑣的準(zhǔn)備，時(shí)刻保持警惕狀態(tài)，隨時(shí)可以上場(chǎng)殺敵。NK細(xì)胞自身帶有精確的識(shí)別敵我的區(qū)分系統(tǒng)，其表面表達(dá)有多種受體，按功能可分為兩大類，即活化受體和抑制性受體。NK細(xì)胞的備戰(zhàn)狀態(tài)可以通過這些受體的配體的相互作用而精確調(diào)控。

NK細(xì)胞主要通過三類武器來抗擊腫瘤細(xì)胞：
❖通過釋放含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞質(zhì)顆粒直接殺傷靶細(xì)胞；
❖釋放細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，通過與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)受體的相互作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；
❖Fc受體CD16與抗體的Fc段結(jié)合，可激發(fā)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）來殺傷細(xì)胞。

因此，NK細(xì)胞也是抗擊腫瘤這個(gè)惡魔的一把重要利器，只要對(duì)NK細(xì)胞像T細(xì)胞裝載“一輛CAR”，也能夠極大的增強(qiáng)其抗擊腫瘤的戰(zhàn)斗力，同時(shí)它也有望克服CAR-T細(xì)胞的諸多缺陷。

三、CAR分子設(shè)計(jì)的異同
到目前為止，多數(shù)CAR-NK細(xì)胞研究中用到的CAR分子結(jié)構(gòu)都是為CAR-T細(xì)胞所設(shè)計(jì)的，這類CAR分子在NK細(xì)胞也可以發(fā)揮作用，但不少研究者仍在致力于進(jìn)一步設(shè)計(jì)和優(yōu)化更適合NK細(xì)胞的CAR分子。表1匯總了目前CAR-NK細(xì)胞研究中用的最常用的CAR分子結(jié)構(gòu)。有研究表明，相比于包含CD28/4-1BB共刺激分子的CAR，表達(dá)有共刺激分子為2B4（NK細(xì)胞特異性的共刺激信號(hào)）CAR的NK細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、細(xì)胞因子分泌能力和抗腫瘤活性，說明NK特異性的共刺激信號(hào)分子在增強(qiáng)CAR-NK性能中具有重要的作用。相信隨著基于NK細(xì)胞的更定制的CAR分子結(jié)構(gòu)的不斷演進(jìn)，CAR-NK細(xì)胞的抗癌戰(zhàn)斗力也會(huì)不斷的提升。
 

表1 目前研究中常用的CAR分子結(jié)構(gòu)^[1]

四、CAR-NK細(xì)胞的制備
不同于T細(xì)胞，NK細(xì)胞用于異體治療時(shí)候引起GvHD的風(fēng)險(xiǎn)極低，因此CAR-NK細(xì)胞有望成為能夠用于異體治療的現(xiàn)貨型產(chǎn)品。同時(shí)，這一特性也大大拓展了NK細(xì)胞的來源。如圖1所示，已經(jīng)有多個(gè)來源的NK細(xì)胞都能夠?qū)崿F(xiàn)臨床級(jí)別的制備，包括來源于外周血（PB)、臍帶血（UCB）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）以及NK細(xì)胞系NK-92。

目前，人外周單核細(xì)胞（PBMC）是最主要的NK細(xì)胞來源，通過NK細(xì)胞分選試劑盒可以輕松獲得高純度NK細(xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)臨床級(jí)別的NK細(xì)胞制備。外周來源NK細(xì)胞制備的CAR-NK細(xì)胞通常會(huì)以CD56^dimCD16⁺NK細(xì)胞為主，其占比可達(dá)到90%以上，這一類NK細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性作用，但其增殖能力較弱。臍帶血也是NK細(xì)胞的一個(gè)重要來源，同PB來源的NK細(xì)胞一樣，臍帶血中的NK細(xì)胞也可以通過分選富集。

與PB來源的NK細(xì)胞不同，UCB來源的NK細(xì)胞多表現(xiàn)出不成熟的表型和較低的細(xì)胞毒性。但無(wú)論是PB還是UCB來源的CAR-NK細(xì)胞，其來源都不均一，導(dǎo)致其難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。iPSC誘導(dǎo)來源的NK細(xì)胞有望解決UCB和PB來源NK難以標(biāo)準(zhǔn)化這一缺陷。iPSC具有無(wú)限傳代特性和基因可編輯性，能夠?qū)崿F(xiàn)CAR-iPSC的制備，而CAR-iPSC可作為一個(gè)穩(wěn)定的來源，持續(xù)不斷地制備高度均一的CAR-NK細(xì)胞。iPSC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞同UCB來源的NK細(xì)胞具有相似的免疫表型，都是以不成熟的NK細(xì)胞為主。
 

圖1 NK細(xì)胞來源及不同CAR-NK制備工藝^[1]

五、CAR-NK細(xì)胞的研究進(jìn)展
目前尚未有CAR-NK細(xì)胞治療產(chǎn)品上市，而且相比于CAR-T細(xì)胞的臨床研究數(shù)量，CAR-NK細(xì)胞的研究仍處于起步階段。但近年來有關(guān)CAR-NK細(xì)胞治療研究的報(bào)道也越來越多，不少企業(yè)都在CAR-NK細(xì)胞治療的賽道上積極布局。通過從在clinicaltrials.gov檢索CAR-NK，我們發(fā)現(xiàn)目前有35項(xiàng)在開展或已經(jīng)終止的CAR-NK細(xì)胞臨床實(shí)驗(yàn)，多數(shù)都是處于Phase1/2的研究階段。

就靶點(diǎn)分布而言，血液腫瘤主要集中在CD19（10項(xiàng)，包含一項(xiàng)雙靶點(diǎn)）、BCMA（3項(xiàng)）、CD33（2項(xiàng)）、CD22（2項(xiàng)，包含一項(xiàng)雙靶點(diǎn)）；實(shí)體腫瘤的治療靶點(diǎn)主要有：NKG2D（4項(xiàng)）、ROBO1（3項(xiàng)）、間皮素（1項(xiàng)）、PSMA（1項(xiàng)）。

就研究地理分布而言，目前開展臨床實(shí)驗(yàn)最多的是中國(guó)，其次是美國(guó)，再就是其他國(guó)家與地區(qū)，如圖2所示。

就療效而言，CAR-NK細(xì)胞的治療效果在一些臨床前和臨床研究中已經(jīng)得到初步驗(yàn)證：在一項(xiàng)靶向CD19的CAR-NK臨床實(shí)驗(yàn)中，11名接受治療的腫瘤患者中有7名患者獲得了完全緩解，而且治療過程中均未出現(xiàn)CRS和神經(jīng)毒性等副作用，展示出NK細(xì)胞良好的應(yīng)用前景。
 

圖2 CAR-NK臨床研究數(shù)量分布圖

六、總結(jié)
相比于T細(xì)胞，NK細(xì)胞具有獨(dú)特的作用機(jī)制，其發(fā)揮免疫作用時(shí)不需要預(yù)活化，且對(duì)把目標(biāo)的識(shí)別不受MHC分子限制，因此NK細(xì)胞適合于異體治療。另外，CAR-NK細(xì)胞治療的毒副作用較弱，通常情況下不會(huì)產(chǎn)生與CAR-T細(xì)胞類似的嚴(yán)重的CRS以及神經(jīng)毒性作用。但CAR-NK細(xì)胞療法也面臨著一些挑戰(zhàn)，比如NK細(xì)胞的增殖和純度、CAR基因遞送工具的選擇以及遞送效率等。但是，對(duì)于CAR-NK的研究目前還處于初始階段，相信隨著研究的不斷深入，這些問題終會(huì)被一一解決，CAR-NK細(xì)胞療法也會(huì)在腫瘤治療領(lǐng)域取得革命性進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：
[1]Xie G, Dong H, Liang Y, Ham JD, Rizwan R, Chen J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 2020;59:102975.

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