普通PCR引物與qPCR引物的對比與選擇詳解
導(dǎo)讀
說起引物，大家都再熟悉不過了。引物，在核苷酸聚合作用的起始時，可以刺激合成另一種大分子，并與反應(yīng)物以共價(jià)鍵形式連接的序列。在核酸化學(xué)中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈。無論是做普通PCR還是熒光定量PCR，設(shè)計(jì)合適的引物是非常關(guān)鍵的一步。
普通PCR和熒光定量PCR的檢測方式具有較大的差別。熒光定量PCR實(shí)時監(jiān)測與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光，普通PCR通過檢測插入DNA中核酸染料的量來測定PCR最終產(chǎn)物量。熒光定量PCR可以通過擴(kuò)增曲線進(jìn)行精確定量，普通PCR則是通過電泳的方式進(jìn)行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)方面，有什么相同點(diǎn)和不同點(diǎn)呢？今天小編就給大家匯總一下。
相同處：
▶ 序列的查找是一致的。
▶ 序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段。
▶ 選取合適的擴(kuò)增片段大小。
▶ 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對。
▶ 避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
▶ Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。
▶ 引物之間的Tm相差避免超過2℃。
▶ 引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。
不同處：
熒光定量PCR 引物
▶ PCR產(chǎn)物長度：要求在300bp以內(nèi)，一般首選80-150bp之間。
▶ 引物特異性：對引物要求高，盡量減少引物二聚體的產(chǎn)生，熔解曲線要求單一產(chǎn)物。
▶ 擴(kuò)增效率：熒光定量 PCR的目的是進(jìn)行定量或者相對定量，擴(kuò)增效率應(yīng)在90%—110%之間。
▶ 多對目的基因同時擴(kuò)增，文獻(xiàn)上查來的引物條件會不同，需要設(shè)計(jì)盡可能條件一致的引物。
▶ 目的基因含量比較低時，需要設(shè)計(jì)靈敏度比較高的引物。
普通PCR 引物
▶ 普通PCR的擴(kuò)增長度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求不同，一般是從150bp到幾千bp不等。
▶ 相對于熒光定量PCR，普通PCR對二級結(jié)構(gòu)要求較低。
▶ 對擴(kuò)增效率要求不高。
▶ 可以選用梯度PCR儀，選擇不同退火溫度，對引物退火溫度要求不需要一致。
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