細(xì)胞外囊泡EVs熒光標(biāo)記的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

圖3.nFCM測(cè)定游離抗體去除方法對(duì)標(biāo)記比例的影響
 

前面介紹的案例都是基于EVs純品的分析，雜質(zhì)顆粒含量非常低，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響相對(duì)較小。進(jìn)一步對(duì)較復(fù)雜的細(xì)胞上清(CCM)進(jìn)行直接檢測(cè)，作者指出對(duì)于EVs純品和CCM樣品，nFCM的結(jié)果令人驚訝的一致，CFSE與CMG陽(yáng)性率例均在90%左右，與超離純化的 HT29 EVs樣品結(jié)果一致，說(shuō)明nFCM平臺(tái)既適用于純的EVs樣品，也可用于細(xì)胞上清樣品中EVs的直接檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景；而在F-NTA平臺(tái)，CFSE與CMC對(duì)于HT29細(xì)胞上清EVs標(biāo)記陽(yáng)性率分別為33%和27%，作者解釋稱可能是由于CCM樣品復(fù)雜的成分導(dǎo)致F-NTA的檢測(cè)存在差異；對(duì)于蛋白比例檢測(cè)，3種EVs蛋白marker總比例高達(dá)188.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)100%，文章指出可能是F-NTA熒光的靈敏度高于散射，大量小顆粒的散射信號(hào)未檢出，導(dǎo)致比例高于100%。
 

圖4.CCM樣品EVs純度和蛋白比例測(cè)定

與F-NTA相比，nFCM還可以利用多色熒光標(biāo)記策略對(duì)sEV亞群進(jìn)行表征。為研究EVs的抗體單標(biāo)和雙標(biāo)之間是否相互影響，作者選取CD9-AF488和CD81-PE分別進(jìn)行單獨(dú)標(biāo)記和雙標(biāo)，對(duì)比標(biāo)記比例的變化。結(jié)果表明這兩個(gè)蛋白之間，不管是單獨(dú)標(biāo)記或雙標(biāo)，陽(yáng)性率差異不顯著；另外，用EVs染料CTR和CD81同時(shí)標(biāo)記EVs，發(fā)現(xiàn)所有CD81陽(yáng)性的EVs的CTR均呈現(xiàn)陽(yáng)性，說(shuō)明CD81陽(yáng)性的顆粒，均是EVs！(圖5)。nFCM可以準(zhǔn)確識(shí)別抗體標(biāo)記的所有EVs，并且確認(rèn)抗體陽(yáng)性率的準(zhǔn)確性。
 

圖5.EVs抗體單標(biāo)和雙標(biāo)的影響
 

綜上，Lonza集團(tuán)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)對(duì)EVs熒光標(biāo)記過(guò)程中的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合對(duì)比，對(duì)EVs純度測(cè)定過(guò)程中染料的選擇、蛋白標(biāo)志物分析、復(fù)雜體系中EVs的表征等進(jìn)行研究，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)中EVs的質(zhì)量控制提供了新思路和新方法。

作者肯定了nFCM用于EVs檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，提出EVs純度表征方法，初次采用CD9/63/81幾種抗體的混合物驗(yàn)證EVs的純度，并對(duì)細(xì)胞上清中的EVs進(jìn)行直接檢測(cè)，得到了跟EVs純品相一致的結(jié)果。另外作者指出nFCM對(duì)于EVs熒光檢測(cè)具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性(圖6)，nFCM可在單顆粒水平對(duì)EVs的散射和熒光進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，單次采樣即可實(shí)現(xiàn)蛋白與EVs(或蛋白間)的“共定位”分析，是EVs質(zhì)量控制中不可或缺的工具。
 

圖6.文中關(guān)于nFCM的評(píng)價(jià)
 

Lonza Walkersville(龍沙集團(tuán))是全球CDMO龍頭企業(yè)，一家以生命科學(xué)為主導(dǎo)，在生物化學(xué)、精細(xì)化工、功能化學(xué)等行業(yè)均處于領(lǐng)先地位的全球性跨國(guó)公司，具有一百多年歷史，總部位于瑞士巴塞爾。

圖7.Lonza集團(tuán)EVs工作流程圖(圖片來(lái)源：Lonza官方網(wǎng)站)

Lonza目前已采購(gòu)3臺(tái)NanoFCM，分別用于EVs研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控和CRO項(xiàng)目，致力于EVs大規(guī)模生產(chǎn)、純化和表征，后續(xù)將應(yīng)用于EVs載藥領(lǐng)域。2021年11月，Lonza收購(gòu)了Codiak公司位于馬薩諸塞州Lexington的外泌體生產(chǎn)基地，正式成為Codiak管線的戰(zhàn)略制造合作伙伴。屆時(shí)Lonza將借助Codiak的高通量外泌體生產(chǎn)技術(shù)向第三方提供服務(wù)，并開發(fā)先進(jìn)的外泌體產(chǎn)品，助力細(xì)胞與基因治療產(chǎn)業(yè)。

參考文獻(xiàn)：

1. Fortunato D, Mladenović D, Criscuoli M, et al. Opportunities and Pitfalls of Fluorescent Labeling Methodologies for Extracellular Vesicle Profiling on High-Resolution Single-Particle Platforms[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(19): 10510.
2. https://www.lonza.com/
3. https://www.lonza.com/news/2021-11-02-13-01