mRNA遞送系統(tǒng)：脂質(zhì)納米顆粒LNP與外泌體的優(yōu)勢比較

在新冠疫情全球大流行的背景之下，mRNA疫苗一戰(zhàn)成名。輝瑞和BioNTech合作開發(fā)的Comirnaty (BNT162b)在2021年銷售收入403.4億美元，Moderna的Spikevax (mRNA-1273)收入176.75億美元。近日，政府層面多次提及mRNA疫苗，國內(nèi)企業(yè)研發(fā)進(jìn)度加速，康熙諾生物、石藥集團(tuán)、沃森生物/艾博生物、斯微生物、艾美疫苗等企業(yè)研發(fā)的新冠mRNA疫苗均已處于不同的臨床階段。未來的十年將是mRNA行業(yè)蓬勃發(fā)展的大時(shí)代。

mRNA疫苗是核酸藥物的一種，核酸藥物從基因水平對患者進(jìn)行治療，只需針對目的基因開發(fā)合適的序列，即可開發(fā)相應(yīng)藥物，避免了研發(fā)過程的盲目性。核酸分子在體液循環(huán)系統(tǒng)中易被降解，具有免疫原性，易被富集于肝臟等器官。目前核酸藥物遞送最常用的是脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle, LNP）載體，但其存在潛在的細(xì)胞毒性、無法靶向特定組織、細(xì)胞攝取效率低等不足，因此如何在保證安全性的前提下將核酸分子成功、有效地遞送到特定的組織器官仍然具有挑戰(zhàn)性。

外泌體作為新型納米藥物遞送系統(tǒng)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就備受學(xué)術(shù)界和工業(yè)界關(guān)注。外泌體作為遞送載體具有諸多優(yōu)勢，如：
1.通過工程化修飾，可靶向到特定的組織和器官，解決傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)無法解決的問題；
2.無免疫原性，包裹的核酸藥物不易降解，降低藥物全身暴露毒性；
3.可跨越血腦屏障，實(shí)現(xiàn)顱內(nèi)藥物遞送�；�于以上特點(diǎn)，外泌體結(jié)合核酸療法已成為新的熱點(diǎn)。

目前，美國Codiak Biosciences公司的exoASO-STAT6外泌體核酸藥物已進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，通過在外泌體表面攜帶反義寡核苷酸（ASO），降低免疫抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。英國EVOX Therapeutics通過其自主研發(fā)的DeliverEXTM平臺(tái)開發(fā)裝載mRNA和siRNA外泌體的產(chǎn)品，期待在罕見病和神經(jīng)類疾病的治療上有所突破。

外泌體向人們展示了其在核酸藥物遞送中無可比擬的優(yōu)勢。由于外泌體本身也含有核酸分子，影響著受體細(xì)胞的生理狀態(tài)。因此在遞送核酸藥物之前，對外泌體自身運(yùn)載核酸分子的解析顯得尤為重要，這將為外泌體的核酸遞送的發(fā)展提供切實(shí)可靠的指導(dǎo)意義。小編給大家分享一篇文章，大家可以思考一下對于當(dāng)紅的mRNA疫苗如果基于外泌體來遞送是不是更具優(yōu)勢？

近日，廈門大學(xué)顏曉梅教授課題組在Journal of Extracellular Vesicles（IF = 26）在線發(fā)表題為“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的研究論文，在單顆粒水平對EVs的DNA進(jìn)行綜合表征，分析了EVs攜帶的DNA種類、含量、分布等情況，有望為外泌體核酸載藥奠定基礎(chǔ)。該研究利用NanoFCM結(jié)合SYTO 16核酸染色和酶消化策略對EVs和DNA進(jìn)行全方位表征，發(fā)現(xiàn)：
 

圖1.EVs中DNA的分布情況
 

2.EVs中的DNA主要是雙鏈DNA（dsDNA），經(jīng)過抗腫瘤藥物誘導(dǎo)，DNA+EVs的分泌量和運(yùn)載的DNA含量均明顯增多；

圖2.抗腫瘤藥物促進(jìn)EVs和DNA的分泌
 

3.首次發(fā)現(xiàn)尺寸排阻色譜（SEC）不能有效地將游離DNA從EVs中分離出來，而密度梯度離心可去除絕大部分游離DNA。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提醒科研人員在利用外泌體包載核酸時(shí)，需要特別注意真實(shí)核酸包裹量和游離核酸的監(jiān)測，選取合適的游離核酸去除方法。
 

圖3.EVs中核酸種類鑒定
 

這項(xiàng)研究為深入了解DNA與EVs的關(guān)系提供了直接和確鑿的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為后期外泌體裝載核酸提供理論經(jīng)驗(yàn)和基礎(chǔ)，有望促進(jìn)外泌體核酸藥物的研發(fā)。NanoFCM可在單顆粒水平對EVs游離的核酸和內(nèi)部核酸進(jìn)行定量分析，確定DNA在EVs中分布情況，優(yōu)化核酸投料量、緩沖液體系、孵育時(shí)間等核酸包裹條件，另外可評估不同純化方法對EVs游離DNA的影響。NanoFCM對EVs核酸藥物裝載研究具有如下優(yōu)勢：

1.可檢測到200 bp 單個(gè)游離的DNA超高靈敏度，實(shí)現(xiàn)EVs內(nèi)部核酸、表面核酸、游離核酸的精確定量分析。
2.檢測范圍覆蓋整個(gè)外泌體（40—200nm）粒徑范圍，對整體外泌體核酸裝載分布進(jìn)行分析。
3.在單顆粒水平測定EVs核酸的種類和含量 ，確定核酸包封率和含量。
4.優(yōu)化核酸裝載條件、純化方法等，獲得高質(zhì)量外泌體核酸藥物。

​參考文獻(xiàn)：
1.Haisheng Liu etal. Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles, 2022, e12206.
2.Thomas C. Roberts et al. Advances inoligonucleotide drug delivery. Nature reviews Drug Discovery (2020),19, pages 673–694
3.Kulkarni, J.A. et al. “The Current Landscape of Nucleic Acid Therapeutics.” Nature Nanotechnology, 2021,16(841):630-643