用非靶向與靶向代謝組學(xué)識別不同炎癥性哮喘表型患者痰液代謝組學(xué)特征
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近日，四川大學(xué)華西醫(yī)院王剛教授團隊在Allergy Asthma & Immunology Research（IF=5.096）上發(fā)表了題為"Sputum Metabolomic Profiling Reveals Metabolic Pathways and Signatures Associated With Inflammatory Phenotypes in Patients With Asthma"的論文。
四川大學(xué)華西醫(yī)院王剛教授是論文第一通訊作者，劉影博士是論文第一作者；上海百趣代謝組學(xué)技術(shù)研究中心創(chuàng)始團隊劉志鵬研究員和研究人員王洪光為論文共同作者。百趣生物為本次研究提供了非靶向代謝組學(xué)+靶向代謝組學(xué)服務(wù)。
哮喘是一種嚴重的全球性慢性炎癥性氣道疾病，其特點是氣道高反應(yīng)性和可逆性氣道阻塞導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作的喘息、氣短、胸悶和咳嗽。同時，哮喘也是一種具有不同表型和內(nèi)型的異質(zhì)性疾病，其中哮喘的炎癥表型（嗜酸性粒細胞性哮喘[EA]、中性粒細胞性哮喘[NA]和少粒細胞性哮喘[PGA]）根據(jù)誘導(dǎo)的痰粒細胞不同比例而被廣泛認知。
盡管可以為不同炎癥表型的患者量身定制管理方法，但針對特定炎癥表型，尤其是NA的治療策略尚且缺乏，這代表了哮喘的醫(yī)療需求有待被滿足。同時，驅(qū)動哮喘不同炎癥表型的分子機制知之甚少，并且可能是異質(zhì)的。因此，識別特定的生物標志物并了解哮喘不同炎癥表型的分子機制非常重要，這可能會導(dǎo)致更加個性化的醫(yī)療。
本研究通過非靶向與靶向代謝組學(xué)方法，以識別不同炎癥性哮喘表型患者的痰液代謝組學(xué)特征和潛在的分子途徑，以期探索這些特征是否與控制哮喘和加重哮喘風(fēng)險相關(guān)。
一、樣本設(shè)置
發(fā)現(xiàn)集（discovery set）119個痰液樣本：
驗證集（validation set）114個痰液樣本：
二、臨床特征
驗證集中，炎癥細胞因子結(jié)果顯示在哮喘表型中，EA患者的IL-5水平最高，而TNF-α、IL-1β、IL-8水平最低（p<0.05）。與之相反，NA組IL-1β水平最高，IL-5水平最低（均P<0.05）（表1）。在12個月的隨訪中，有3例（10%）NA患者和3例（6.1%）PGA患者失訪。最后，108例哮喘患者（EA,n=35；NA,n=27；PGA,n=46）納入哮喘加重分析。結(jié)果顯示，不同表型組中，嚴重哮喘發(fā)作的患者比例（EA vs NA vs PGA:17.1% vs 37% vs 6.5%,P=0.004）和嚴重哮喘發(fā)作次數(shù)的頻率（EAvsNA vs PGA: 0.29±0.75 vs 0.70±1.33 vs 0.09±0.35,P=0.004）存在顯著差異（表1）。
表1. 數(shù)值表示為平均值±標準差、數(shù)字(%)或中位數(shù)（下四分位數(shù)、上四分位數(shù)）。EA，嗜酸性粒細胞性哮喘；NA，中性粒細胞性哮喘；PGA，少粒細胞哮喘；BMI，體重指數(shù)；BDP，二丙酸倍氯米松；LTRA，白三烯受體拮抗劑；SPT，皮膚點刺試驗；ACQ，哮喘控制問卷；AQLQ，哮喘生活質(zhì)量問卷；FEV1，一秒用力呼氣量；FVC，用力肺活量；BDR，支氣管擴張劑反應(yīng)；FeNO，呼出的一氧化氮分數(shù)；IgE，免疫球蛋白E；TNF，腫瘤壞死因子；干擾素，干擾素；IL，白細胞介素；MDC，巨噬細胞衍生的趨化因子。與EA組比, aP<0.01, bP<0.05; 與NA組相比, cP<0.01, dP<0.05。
三、非靶向代謝譜可區(qū)分發(fā)現(xiàn)集中不同炎癥性哮喘表型和健康受試者
OPLS-DA分析表明不同哮喘炎癥表型之間明顯分離。此外，哮喘組也與健康對照組明顯分開（圖1）。每個模型中Q2截距的低值表明這些模型的穩(wěn)健性，因此在所有比較中顯示過擬合的風(fēng)險較低，組間差異顯著。
圖1. 發(fā)現(xiàn)集中，非靶向代謝譜在不同炎癥表型哮喘和健康受試者中有所區(qū)別。(A-D) 不同炎癥性哮喘表型和健康受試者的PCA模型評分圖；(E-H) 不同炎癥性哮喘表型與健康受試者OPLS-DA模型的評分圖；(I-L) 不同炎癥性哮喘表型與健康受試者OPLS-DA模型的置換檢驗
結(jié)合單變量和多變量統(tǒng)計分析，基于OPLS-DA模型的VIP>1、倍數(shù)變化<0.83或>1.2和FDR<0.05，在不同的哮喘表型和健康受試者之間共發(fā)現(xiàn)77種差異代謝物（圖2）。
應(yīng)用MetPA代謝組學(xué)通路拓撲結(jié)構(gòu)富集分析方法來評估不同哮喘表型和健康受試者中病理生理機制潛在途徑的重要性（圖3）。結(jié)果顯示，組氨酸代謝途徑在哮喘組和健康對照組之間存在差異（P=0.019；影響值=0.189）。EA和NA之間的差異代謝物富集在甘油磷脂代謝（P=0.015；影響值=0.121）、煙酸和煙酰胺代謝（P=0.020；影響值=0.332）和組氨酸代謝（P=0.022；影響值=0.189）。EA和PGA之間的差異代謝物富集在甘油磷脂代謝（P=0.001；沖擊值=0.186）、亞油酸代謝（P=0.001；影響值=1.000）、組氨酸代謝（P=0.014；影響值=0.189）和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成（P=0.046；影響值=0.500）。NA和PGA之間的差異代謝物富集在亞油酸代謝（P=0.002；影響值=1.000）、甘油磷脂代謝（P=0.010；影響值=0.160）和煙酸、煙酰胺代謝（P=0.015；影響值=0.332）。
圖3. 基于能區(qū)分不同炎癥表型哮喘和健康受試者痰樣本的代謝物的代謝通路分析。(A) 哮喘與健康；(B) EA和NA；(C) EA和PGA；(D) NA和PGA。圓圈表示可能涉及類分離的代謝途徑。EA，嗜酸性哮喘；NA，中性粒細胞哮喘；PGA, 少粒細胞性哮喘。
五、靶向定量驗證集中不同炎癥性哮喘表型與健康受試者之間的差異代謝物
經(jīng)過文獻調(diào)研和靶標定量方法檢測分析評估，選擇了39個差異表達代謝物，在驗證集患者中進行靶向定量，其中24種代謝物在哮喘炎癥表型之間顯著差異表達（表2），其中9種代謝物的顯著P值為0.001或更低。組胺以及組氨酸代謝相關(guān)代謝物的表達量最高，而5-L-谷氨�；�-L-丙氨酸、煙酰胺、二氫胸腺嘧啶、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸在EA患者中表達量最低。這些數(shù)據(jù)與代謝通路拓撲結(jié)構(gòu)富集分析結(jié)果一致，表明組氨酸代謝可能在EA中起重要作用。在NA患者中，涉及嘌呤代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、牛磺酸和亞�；撬岽x以及氨酰tRNA生物合成的腺苷5'-單磷酸、甘油酸、牛磺酸、二氫胸腺嘧啶、L-亮氨酸、酪胺、L-谷氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸和蘇氨酰苯丙氨酸的濃度最高，而甘油磷脂代謝相關(guān)代謝物甘油磷酸膽堿的濃度最低，與之相反，PGA中甘油磷膽堿的濃度最高。而且，PGA患者的不飽和脂肪酸相關(guān)代謝產(chǎn)物，十七烷酸和油酸的生物合成也最高，但十二烷酸的濃度最低（表2）。
表2. 數(shù)值表示為中位數(shù)（下四分位數(shù)、上四分位數(shù)）。EA，嗜酸性粒細胞性哮喘；NA，中性粒細胞性哮喘；PGA，少粒細胞哮喘。與EA組比, aP<0.01, bP<0.05; 與NA組相比, cP<0.01, dP<0.05。
此外，通過受試者工作特征（ROC）曲線檢測這些差異表達的代謝物，以區(qū)分不同的炎癥哮喘表型。牛磺酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸和蘇氨酰苯丙氨酸可作為鑒別NA與EA或PGA的候選代謝標記物，其AUC范圍為0.816~0.975（P<0.05）（圖4）。然而，由于單一代謝物的AUC均小于0.7，故不能有效區(qū)分EA和PGA。
圖4. 區(qū)分NA和EA (A) 或NA和PGA (B) 的代謝物受試者工作特征（ROC）曲線。EA，嗜酸性哮喘；NA，中性粒細胞哮喘；PGA, 少粒細胞性哮喘。
六、驗證集中差異代謝物與臨床指標和炎癥特征的相關(guān)性
相關(guān)性分析顯示，差異表達的代謝物與所有哮喘受試者的肺功能、哮喘控制和炎癥特征相關(guān)（圖5）。在12個月的隨訪中，使用logistic回歸和負二項回歸模型探討所有哮喘患者痰液代謝物與嚴重哮喘發(fā)作之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，腺苷5'-單磷酸與嚴重哮喘加重顯著相關(guān)（表3）。校正年齡、性別、BMI和FEV1%之后，腺苷5'-單磷酸與經(jīng)歷嚴重哮喘發(fā)作的患者比例以及嚴重哮喘發(fā)作頻率呈正相關(guān)(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.050；RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.008)。同時，尿囊素和煙酰胺與嚴重哮喘發(fā)作頻率均呈正相關(guān)(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.043；RRadj=1.001,95%CI=[1.000,1.002],P=0.021)。此外，對嗜酸性哮喘(EA)或非嗜酸性哮喘(NEA)進行了亞組分析。結(jié)果顯示，腺苷5'-單磷酸仍與NEA組的嚴重哮喘惡化顯著相關(guān)，但與EA組無關(guān)。而且，我們還發(fā)現(xiàn)腺嘌呤、別胱硫醚和煙酰胺也與NEA組嚴重哮喘發(fā)作顯著相關(guān)。然而，由于EA組的樣本量有限，只發(fā)現(xiàn)酪胺與嚴重哮喘發(fā)作的頻率相關(guān)。
圖5. 驗證集中所有哮喘受試者差異代謝物與臨床和炎癥特征相關(guān)性熱圖。FEV1，一秒用力呼氣量；FVC，用力肺活量；ACQ，哮喘控制問卷；AQLQ，哮喘生活質(zhì)量問卷；FeNO，呼出的一氧化氮分數(shù)；IgE，免疫球蛋白 E；TNF，腫瘤壞死因子；干擾素，干擾素；IL，白細胞介素；MDC，巨噬細胞衍生的趨化因子。
表3. 根據(jù)年齡、性別、BMI和FEV1進行了校正。OR，優(yōu)勢比；CI，置信區(qū)間；BMI，體重指數(shù)；FEV1，一秒用力呼氣量。
七、結(jié)論
不同炎癥性哮喘表型的代謝組學(xué)研究分析可以發(fā)現(xiàn)，不同亞型間累計有77個差異顯著代謝物變化和5條差異顯著代謝通路變化。這些代謝組學(xué)通路主要是組氨酸代謝、甘油磷脂代謝、煙酸和煙酰胺代謝、亞油酸代謝、以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。此外，還發(fā)現(xiàn)差異代謝物與哮喘的臨床和炎癥特征相關(guān)，這些代謝物可能能夠作為不同炎癥性哮喘表型的潛在治療靶點。
文/阿趣代謝組學(xué)
下面跟著小趣一起，透過「痰液代謝組學(xué)」認識不同炎癥亞型哮喘吧。
近日，四川大學(xué)華西醫(yī)院王剛教授團隊在Allergy Asthma & Immunology Research（IF=5.096）上發(fā)表了題為"Sputum Metabolomic Profiling Reveals Metabolic Pathways and Signatures Associated With Inflammatory Phenotypes in Patients With Asthma"的論文。
哮喘是一種嚴重的全球性慢性炎癥性氣道疾病，其特點是氣道高反應(yīng)性和可逆性氣道阻塞導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作的喘息、氣短、胸悶和咳嗽。同時，哮喘也是一種具有不同表型和內(nèi)型的異質(zhì)性疾病，其中哮喘的炎癥表型（嗜酸性粒細胞性哮喘[EA]、中性粒細胞性哮喘[NA]和少粒細胞性哮喘[PGA]）根據(jù)誘導(dǎo)的痰粒細胞不同比例而被廣泛認知。
盡管可以為不同炎癥表型的患者量身定制管理方法，但針對特定炎癥表型，尤其是NA的治療策略尚且缺乏，這代表了哮喘的醫(yī)療需求有待被滿足。同時，驅(qū)動哮喘不同炎癥表型的分子機制知之甚少，并且可能是異質(zhì)的。因此，識別特定的生物標志物并了解哮喘不同炎癥表型的分子機制非常重要，這可能會導(dǎo)致更加個性化的醫(yī)療。
本研究通過非靶向與靶向代謝組學(xué)方法，以識別不同炎癥性哮喘表型患者的痰液代謝組學(xué)特征和潛在的分子途徑，以期探索這些特征是否與控制哮喘和加重哮喘風(fēng)險相關(guān)。
一、樣本設(shè)置
發(fā)現(xiàn)集（discovery set）119個痰液樣本：
驗證集（validation set）114個痰液樣本：
二、臨床特征
驗證集中，炎癥細胞因子結(jié)果顯示在哮喘表型中，EA患者的IL-5水平最高，而TNF-α、IL-1β、IL-8水平最低（p<0.05）。與之相反，NA組IL-1β水平最高，IL-5水平最低（均P<0.05）（表1）。在12個月的隨訪中，有3例（10%）NA患者和3例（6.1%）PGA患者失訪。最后，108例哮喘患者（EA,n=35；NA,n=27；PGA,n=46）納入哮喘加重分析。結(jié)果顯示，不同表型組中，嚴重哮喘發(fā)作的患者比例（EA vs NA vs PGA:17.1% vs 37% vs 6.5%,P=0.004）和嚴重哮喘發(fā)作次數(shù)的頻率（EAvsNA vs PGA: 0.29±0.75 vs 0.70±1.33 vs 0.09±0.35,P=0.004）存在顯著差異（表1）。
三、非靶向代謝譜可區(qū)分發(fā)現(xiàn)集中不同炎癥性哮喘表型和健康受試者
OPLS-DA分析表明不同哮喘炎癥表型之間明顯分離。此外，哮喘組也與健康對照組明顯分開（圖1）。每個模型中Q2截距的低值表明這些模型的穩(wěn)健性，因此在所有比較中顯示過擬合的風(fēng)險較低，組間差異顯著。
結(jié)合單變量和多變量統(tǒng)計分析，基于OPLS-DA模型的VIP>1、倍數(shù)變化<0.83或>1.2和FDR<0.05，在不同的哮喘表型和健康受試者之間共發(fā)現(xiàn)77種差異代謝物（圖2）。
圖2. 發(fā)現(xiàn)組中不同炎癥表型哮喘和健康受試者痰樣本中差異代謝物熱圖
四、發(fā)現(xiàn)集中的代謝組學(xué)通路分析應(yīng)用MetPA代謝組學(xué)通路拓撲結(jié)構(gòu)富集分析方法來評估不同哮喘表型和健康受試者中病理生理機制潛在途徑的重要性（圖3）。結(jié)果顯示，組氨酸代謝途徑在哮喘組和健康對照組之間存在差異（P=0.019；影響值=0.189）。EA和NA之間的差異代謝物富集在甘油磷脂代謝（P=0.015；影響值=0.121）、煙酸和煙酰胺代謝（P=0.020；影響值=0.332）和組氨酸代謝（P=0.022；影響值=0.189）。EA和PGA之間的差異代謝物富集在甘油磷脂代謝（P=0.001；沖擊值=0.186）、亞油酸代謝（P=0.001；影響值=1.000）、組氨酸代謝（P=0.014；影響值=0.189）和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成（P=0.046；影響值=0.500）。NA和PGA之間的差異代謝物富集在亞油酸代謝（P=0.002；影響值=1.000）、甘油磷脂代謝（P=0.010；影響值=0.160）和煙酸、煙酰胺代謝（P=0.015；影響值=0.332）。
五、靶向定量驗證集中不同炎癥性哮喘表型與健康受試者之間的差異代謝物
經(jīng)過文獻調(diào)研和靶標定量方法檢測分析評估，選擇了39個差異表達代謝物，在驗證集患者中進行靶向定量，其中24種代謝物在哮喘炎癥表型之間顯著差異表達（表2），其中9種代謝物的顯著P值為0.001或更低。組胺以及組氨酸代謝相關(guān)代謝物的表達量最高，而5-L-谷氨�；�-L-丙氨酸、煙酰胺、二氫胸腺嘧啶、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸在EA患者中表達量最低。這些數(shù)據(jù)與代謝通路拓撲結(jié)構(gòu)富集分析結(jié)果一致，表明組氨酸代謝可能在EA中起重要作用。在NA患者中，涉及嘌呤代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、牛磺酸和亞�；撬岽x以及氨酰tRNA生物合成的腺苷5'-單磷酸、甘油酸、牛磺酸、二氫胸腺嘧啶、L-亮氨酸、酪胺、L-谷氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸和蘇氨酰苯丙氨酸的濃度最高，而甘油磷脂代謝相關(guān)代謝物甘油磷酸膽堿的濃度最低，與之相反，PGA中甘油磷膽堿的濃度最高。而且，PGA患者的不飽和脂肪酸相關(guān)代謝產(chǎn)物，十七烷酸和油酸的生物合成也最高，但十二烷酸的濃度最低（表2）。
此外，通過受試者工作特征（ROC）曲線檢測這些差異表達的代謝物，以區(qū)分不同的炎癥哮喘表型。牛磺酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰絲氨酸和蘇氨酰苯丙氨酸可作為鑒別NA與EA或PGA的候選代謝標記物，其AUC范圍為0.816~0.975（P<0.05）（圖4）。然而，由于單一代謝物的AUC均小于0.7，故不能有效區(qū)分EA和PGA。
六、驗證集中差異代謝物與臨床指標和炎癥特征的相關(guān)性
相關(guān)性分析顯示，差異表達的代謝物與所有哮喘受試者的肺功能、哮喘控制和炎癥特征相關(guān)（圖5）。在12個月的隨訪中，使用logistic回歸和負二項回歸模型探討所有哮喘患者痰液代謝物與嚴重哮喘發(fā)作之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，腺苷5'-單磷酸與嚴重哮喘加重顯著相關(guān)（表3）。校正年齡、性別、BMI和FEV1%之后，腺苷5'-單磷酸與經(jīng)歷嚴重哮喘發(fā)作的患者比例以及嚴重哮喘發(fā)作頻率呈正相關(guān)(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.050；RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.008)。同時，尿囊素和煙酰胺與嚴重哮喘發(fā)作頻率均呈正相關(guān)(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.043；RRadj=1.001,95%CI=[1.000,1.002],P=0.021)。此外，對嗜酸性哮喘(EA)或非嗜酸性哮喘(NEA)進行了亞組分析。結(jié)果顯示，腺苷5'-單磷酸仍與NEA組的嚴重哮喘惡化顯著相關(guān)，但與EA組無關(guān)。而且，我們還發(fā)現(xiàn)腺嘌呤、別胱硫醚和煙酰胺也與NEA組嚴重哮喘發(fā)作顯著相關(guān)。然而，由于EA組的樣本量有限，只發(fā)現(xiàn)酪胺與嚴重哮喘發(fā)作的頻率相關(guān)。
七、結(jié)論
不同炎癥性哮喘表型的代謝組學(xué)研究分析可以發(fā)現(xiàn)，不同亞型間累計有77個差異顯著代謝物變化和5條差異顯著代謝通路變化。這些代謝組學(xué)通路主要是組氨酸代謝、甘油磷脂代謝、煙酸和煙酰胺代謝、亞油酸代謝、以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。此外，還發(fā)現(xiàn)差異代謝物與哮喘的臨床和炎癥特征相關(guān)，這些代謝物可能能夠作為不同炎癥性哮喘表型的潛在治療靶點。
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