SDS-PAGE 的實(shí)驗(yàn)原理及各組分的作用

SDS-PAGE即：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)是一種根據(jù)凝膠電泳蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行蛋白分離的常用技術(shù)。

SDS-PAGE 的實(shí)驗(yàn)原理
我們知道，任何帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)取決于其凈電荷、分子半徑和外加場(chǎng)的大小。但是天然折疊蛋白質(zhì)的的不同之處在于它們的凈電荷和分子半徑都與分子量無關(guān)。蛋白的凈電荷取決于蛋白質(zhì)中正負(fù)氨基酸的總和以及蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的分子半徑。 

因此，在天然狀態(tài)下，具有相同分子量的不同蛋白質(zhì)會(huì)根據(jù)其電荷和 3D 形狀在電場(chǎng)中以不同的速度遷移。SDS-PAGE電泳技術(shù)需要做的是將蛋白質(zhì)還原為線性分子來破壞三級(jí)結(jié)構(gòu)，并以某種方式來掩蓋蛋白質(zhì)的內(nèi)在凈電荷，從而根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行蛋白區(qū)分。

所以，SDS-PAGE 的工作原理的實(shí)質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)在施加電場(chǎng)的影響下通過篩分基質(zhì)（凝膠）的不同遷移率，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量來分離蛋白質(zhì)。



SDS在 SDS-PAGE 中的作用
SDS 是一種存在于 SDS-PAGE 樣品緩沖液中的去污劑，其中有一點(diǎn)沸騰，還有一種還原劑（通常是 DTT 或ββ-ME 分解蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)二硫鍵），它會(huì)破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這使折疊的蛋白質(zhì)變成線性分子。

SDS 還用均勻的負(fù)電荷覆蓋蛋白質(zhì)，從而掩蓋了 R 基團(tuán)上的固有電荷。SDS 與線性蛋白質(zhì)的結(jié)合相當(dāng)均勻（大約 1.4g SDS/1g 蛋白質(zhì)），SDS 也存在于凝膠中，以確保一旦蛋白質(zhì)被線性化并掩蓋了它們的電荷，它們?cè)谡麄�(gè)運(yùn)行過程中都保持這種狀態(tài)。

決定 SDS 包被蛋白質(zhì)遷移率的主要因素是其分子半徑。SDS 包被的蛋白質(zhì)已被證明是線性分子，寬 18 埃，其長(zhǎng)度與其分子量成正比關(guān)系，所以分子半徑是由蛋白質(zhì)的分子量的大小索決定。

凝膠基質(zhì)在 SDS-PAGE 中的作用
在施加的電場(chǎng)中，經(jīng)過 SDS 處理的蛋白質(zhì)現(xiàn)在將根據(jù)其分子量以不同的速率向正極移動(dòng)。由于凝膠基質(zhì)的高摩擦環(huán)境，這些不同的流動(dòng)性將被夸大。

由于聚丙烯酰胺具有化學(xué)惰性，而且它可以很容易地制成各種濃度以產(chǎn)生不同的孔徑，從而提供適合各種分離的條件，因此常用它作為SDS-PAGE的凝膠基質(zhì)。

不連續(xù)緩沖系統(tǒng)解釋
為了通過凝膠將電流從陰極（負(fù)）傳導(dǎo)到陽極（正），顯然需要緩沖液。大多數(shù)使用不連續(xù)的Laemmli 緩沖系統(tǒng)。“不連續(xù)”只是意味著凝膠和罐中的緩沖液不同。

通常，系統(tǒng)設(shè)置有 pH 6.8 的濃縮凝膠、Tris-HCl 緩沖、Tris-HCl 緩沖至 pH 8.8 的運(yùn)行凝膠和 pH 8.3 的電極緩沖液。濃縮膠的丙烯酰胺濃度較低，因?yàn)槲覀儾幌Ｍ�蛋白質(zhì)在這里分離，而流動(dòng)膠的丙烯酰胺濃度較高，能夠阻止蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)。
 
SDS-PAGE 的工作原理
1.堆積膠在 SDS-PAGE 中的作用
當(dāng)電源打開時(shí)，pH 8.3 電極緩沖液中帶負(fù)電荷的甘氨酸離子被迫進(jìn)入濃縮膠，此處的 pH 值為 6.8 。在這種環(huán)境下，甘氨酸主要轉(zhuǎn)變?yōu)閮尚噪x子（帶中性電荷）狀態(tài)。這種電荷損失導(dǎo)致甘氨酸離子在電場(chǎng)中移動(dòng)非常緩慢。

Cl- 與 Tris 反離子（現(xiàn)在向陽極移動(dòng)）的分離產(chǎn)生了一個(gè)帶有陡峭電壓梯度的狹窄區(qū)域，將甘氨酸離子拉到它后面，導(dǎo)致遷移離子的兩個(gè)狹窄分離的前沿；高度流動(dòng)的 Cl- 前沿，其次是較慢的，主要是中性甘氨酸前沿。 

凝膠樣品中的所有蛋白質(zhì)的電泳遷移率介于甘氨酸和 Cl- 遷移率的極值之間，因此當(dāng)兩個(gè)前沿掃過樣品孔時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)集中到 Cl 之間的狹窄區(qū)域 - 和甘氨酸前沿。 

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移時(shí)遇到運(yùn)行的凝膠時(shí)，在那里 pH 值切換到 8.8。在此 pH 值下，甘氨酸分子大多帶負(fù)電荷，遷移速度比蛋白質(zhì)快得多，此時(shí)，分子量的大小決定了其遷移的速度，逐漸實(shí)現(xiàn)分離。

蛋白分離
一旦蛋白質(zhì)進(jìn)入電泳凝膠，它們就會(huì)分離，因?yàn)檩^高分子量的蛋白質(zhì)通過多孔丙烯酰胺凝膠的速度比較低分子量的蛋白質(zhì)更慢。通過改變丙烯酰胺濃度，可以根據(jù)要分離的蛋白質(zhì)的大小來改變凝膠中孔的大小。

典型值顯示在下表 1 中。


在SDS-PAGE中 ，對(duì)于更廣泛的分離范圍，或難以分離的蛋白質(zhì)，可以使用具有不斷增加丙烯酰胺濃度的層的梯度凝膠。