人源化單克隆抗體CD28的共刺激作用與研究進(jìn)展

人源化單克隆抗體CD28
單克隆抗體(Mab)目前已被納入惡性腫瘤、移植排斥、自身免疫和傳染病等以及一系列新適應(yīng)癥的靶向治療方案。而人源單克隆抗體(Human monoclonal antibody，HuMAb) 更是成為未來抗體發(fā)展的主要研究方向。HuMAb是指完全由人類基因編碼表達(dá)的單克隆抗體，它具有更豐富的表位、更低的免疫原性、更長(zhǎng)的半衰期、更佳的生物活性等優(yōu)勢(shì)，使之在體內(nèi)中發(fā)揮著良好的用途，如體內(nèi)診斷、傳染病預(yù)防、抗體療法和疾病預(yù)后判斷等。其中，CD28作為一個(gè)機(jī)制清晰的老靶點(diǎn)，它在免疫治療中發(fā)揮著重要的價(jià)值。

CD28分子是由二硫鍵合的44 kDa亞基組成的同源二聚體糖蛋白。每個(gè)CD28單體含有134個(gè)細(xì)胞外氨基酸，具有單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和短細(xì)胞質(zhì)尾。CD28的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白可變區(qū)域結(jié)構(gòu)域顯示其同源性。CD28分子的編碼基因由四個(gè)外顯子組成，每個(gè)外顯子分別定義其蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域。

CD28共刺激作用
T細(xì)胞的完全活化依賴于T細(xì)胞抗原受體（T-cell receptor, TCR）提供的抗原刺激信號(hào)和共刺激受體提供的共刺激信號(hào)。CD28是T細(xì)胞中關(guān)鍵的共刺激受體，它調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育、分化、代謝、遷移等生理過程[1] 。初始T細(xì)胞的完全活化通常需要三個(gè)信號(hào)，第一信號(hào)是抗原和抗原受體的結(jié)合，第二信號(hào)是共刺激信號(hào)，第三信號(hào)是細(xì)胞因子信號(hào)。CD28作為共刺激分子，參與了第二信號(hào)的接收。

對(duì)于Tc細(xì)胞（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）和Th細(xì)胞（輔助性T細(xì)胞）來說，共刺激信號(hào)傳導(dǎo)降低了T細(xì)胞活化的閾值，促進(jìn)了T細(xì)胞的增殖和分化。在沒有CD28共刺激存在時(shí)，初始T細(xì)胞不會(huì)被活化，也不會(huì)發(fā)生應(yīng)答。CD28參與的共刺激過程能產(chǎn)生多方面重要的分子效應(yīng)：

1. 誘導(dǎo)T細(xì)胞表面IL-2R（白介素-2受體）的表達(dá)，從而  允許細(xì)胞接收第三信號(hào)；

2. 使Th細(xì)胞開始分泌大量的細(xì)胞因子和趨化因子；

3. 誘導(dǎo)表達(dá)和上調(diào)表達(dá)在Th和Tc細(xì)胞內(nèi)其他共刺激和調(diào)節(jié)分子[2]。

當(dāng)DC（樹突狀細(xì)胞）表面的特異pMHC結(jié)合了初始Th或Tc細(xì)胞表面多拷貝的某個(gè)TCR時(shí)將傳遞第一信號(hào)。TCR和pMHC結(jié)合，將導(dǎo)致與TCR緊密相鄰的CD3鏈上ITAM被Lck激酶磷酸化。其他胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)酶隨后被募集到此處，與CD4或CD8共受體及CD3鏈的胞質(zhì)尾區(qū)相接觸。這些酶一起介導(dǎo)酶級(jí)聯(lián)化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致其他多個(gè)酶的活化。當(dāng)這種活化級(jí)聯(lián)反應(yīng)出現(xiàn)于多個(gè)TCR時(shí)，T細(xì)胞將接收到第一信號(hào) [2] 。
 

在多數(shù)情況下，TCR和pMHC的結(jié)合不足以完全活化一個(gè)初始Th細(xì)胞或Tc細(xì)胞，共刺激信號(hào)傳導(dǎo)形式的第二信號(hào)是必需的。對(duì)于Th細(xì)胞，接收第一信號(hào)后導(dǎo)致Th細(xì)胞表面的重要共刺激分子CD28的表達(dá)上調(diào)。然而CD28要傳遞第二信號(hào)到Th細(xì)胞核內(nèi)，其必須同遞呈活化性pMHC的DC表面的配體B7分子相結(jié)合。當(dāng)免疫突觸最初開始形成時(shí)，成熟的DC細(xì)胞并沒有表達(dá)最佳水平的B7分子，第一信號(hào)傳遞到Th細(xì)胞及CD28和B7最初結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)果是Th細(xì)胞表面跨膜蛋白CD40L的表達(dá)上調(diào)，一旦Th細(xì)胞表面的CD40L與DC表面的CD40結(jié)合，DC將大大提高其B7的表達(dá)及隨后其同Th細(xì)胞表面CD28的更強(qiáng)結(jié)合。最終，強(qiáng)有力的第二信號(hào)被傳遞到T細(xì)胞內(nèi)，從而提高活化性胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，而這種出現(xiàn)在T細(xì)胞內(nèi)的活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也是第一信號(hào)的結(jié)果。

CD28研究進(jìn)展
由于CD28表達(dá)于T細(xì)胞表面，且CD28分子的表達(dá)情況在健康人中具有一定的年齡相關(guān)性[3]。人剛出生以后，人體體內(nèi)循環(huán)中幾乎沒有CD28-T細(xì)胞，但隨著年齡的增加，CD28-T細(xì)胞的數(shù)量便逐漸增多。CD28分子的缺失減少了T細(xì)胞抗原受體的多樣性，抑制了抗原誘導(dǎo)的增殖[4]。CD28表達(dá)減少通常被認(rèn)為是T細(xì)胞衰老的標(biāo)志[5]，且CD28缺失是老年人免疫功能不全的關(guān)鍵預(yù)測(cè)因子。
 

抗CD28單克隆抗體通過靶向CD28分子胞外結(jié)構(gòu)起作用，根據(jù)其靶抗原表位及其對(duì)T細(xì)胞的刺激活性可大致分為2類：常規(guī)抗CD28特異性抗體和抗CD28超激動(dòng)抗體（又名CD28超激動(dòng)劑，即CD28sa）。在大多數(shù)藥物研發(fā)中，抗CD28抗體藥物主要是指CD28sa。

早期的CD28sa分子起源于1990年后期Thomas Hünig的實(shí)驗(yàn)室，其基于大鼠模型為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、多發(fā)性硬化癥、格林-巴雷綜合征或1型糖尿病等自身免疫性疾病開發(fā)的免疫療法項(xiàng)目。

然而，CD28的靶向治療手段的應(yīng)用卻是“命運(yùn)多舛”。2006年，CD28激動(dòng)劑（TNG1412）進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，但卻以悲劇收?qǐng)觯�并成為�?dāng)年免疫治療領(lǐng)域的頭條新聞。爾后，TNG1412更名TAB08。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度控制在較低水平時(shí)，試驗(yàn)效果良好，目前仍處于臨床試驗(yàn)階段用于腫瘤治療；2016年，強(qiáng)生公司的CD28單抗藥物（FR04）能夠抑制T細(xì)胞的增殖，活化以及阻斷信號(hào)通路來達(dá)到免疫耐受的效果；2020年10月，首款CD28拮抗劑免疫療法FR104獲得歐洲專利；近年來科研人員對(duì)CD28 單克隆抗體的研究依然沒有停止......

研究1
南方科技大學(xué)的田瑞軍、李鵬飛和來自中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的王方軍在《Cell Chem. Biol.》期刊上發(fā)表了一篇以“Motif-DependentImmune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics”為題的論文[6] 。
 

他們利用CD28通過酪氨酸磷酸化(pY)這種翻譯后修飾激活，然后招募下游信號(hào)蛋白形成復(fù)合物。這些復(fù)合物對(duì)于T細(xì)胞的激活與TCR信號(hào)通路至關(guān)重要，因此分析其相互作用組有助于更全面地理解CD28的調(diào)節(jié)功能及其在免疫治療中的應(yīng)用。

研究2
2017年10月，中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所許琛琦研究組與牛津大學(xué)Omer Dushek研究組合作在《Nature Structural & Molecular Biology》在線發(fā)表了題為“Dynamic regulation of CD28 conformation and signaling by charged lipids and ions”的論文[7]。
 

該項(xiàng)研究揭示了CD28的活性調(diào)控機(jī)制以及T細(xì)胞高抗原敏感性的信號(hào)基礎(chǔ)，提出了TCR-Ca2+-CD28所組成的正反饋調(diào)控環(huán)路可以迅速放大T細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度的機(jī)制；揭示了TCR-Ca2+-CD28之間由此形成了正反饋環(huán)路，可以迅速放大抗原刺激信號(hào)，從而為T細(xì)胞產(chǎn)生高抗原敏感性提供信號(hào)基礎(chǔ)。

總結(jié)    
無論是抗腫瘤免疫治療還是器官移植后免疫抑制治療，以及機(jī)會(huì)性感染的控制，共刺激分子CD28都不失為一個(gè)有用的敏感靶點(diǎn)。通過流式技術(shù)監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞的表型，能夠?yàn)榕R床研究和治療提供有關(guān)受體免疫狀態(tài)極具價(jià)值的信息。我們相信，在未來幾年里，市場(chǎng)上將會(huì)有越來越多以CD28為靶點(diǎn)的生物制劑，為廣大深受免疫疾病困擾的患者帶來福音。

同立海源CD28驗(yàn)證數(shù)據(jù)
高純度HPLC和SDS-PAGE驗(yàn)證

測(cè)試結(jié)果顯示純度達(dá)到藥用級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（≥95%）

高生物活性經(jīng)細(xì)胞水平生物活性驗(yàn)證

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD28抗體與Jurkat細(xì)胞
（人外周血白血病T細(xì)胞）
表面CD28的結(jié)合活性，CD28抗體在低濃度
100-300ng/mL下仍然表現(xiàn)出優(yōu)良的結(jié)合能力

參考文獻(xiàn)：
[1]Chen, L. & Flies, D.B. Molecular mechanisms of T cell co-stimulation and co- inhibition. Nat. Rev. Immunol. 13, 227–242 (2013).
[2]塔克·馬可、瑪麗·桑德斯．免疫應(yīng)答導(dǎo)論：科學(xué)出版社，2012：159-160
[3]FAGNONI F F, VESCOVINI R, MAZZOLA M, et al. Expansion of cytotoxic CD8+ CD28- T cells in healthy ageing people, including centenarians [J]. Immunology, 1996, 88(4): 501-7.
[4] QIN L, JING X, QIU Z, et al. Aging of immune system: Immune signature from peripheral blood lymphocyte subsets in 1068 healthy adults [J]. Aging (Albany NY), 2016, 8(5): 848-59.
[5] VALLEJO A N, NESTEL A R, SCHIRMER M, et al. Aging-related deficiency of CD28 expression in CD4+ T cells is associated with the loss of gene-specific nuclear factor binding activity [J]. J Biol Chem, 1998, 273(14): 8119-29. 
[6]Motif-DependentImmune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics,Xiong Chen, Shanping Ji, Zheyi Liu, et al.Cell Chem. Biol.DOI：10.1016/j.chembiol.2022.01.005.
[7]Dynamic regulation of CD28 conformation and signaling by charged lipids and ions,Wei Yang,Weiling Pan,Shuokai Chen,et al.Nature Structural & Molecular Biology,2017-10-23 , DOI: 10.1038/nsmb.3489 .