人牙周膜干細(xì)胞在相關(guān)信號(hào)通路下進(jìn)行循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化

正畸牙齒移動(dòng)過程中的生物學(xué)基礎(chǔ)是牙槽骨重塑。牙槽骨重塑是一個(gè)連續(xù)的、復(fù)雜的、協(xié)調(diào)的生物學(xué)過程，涉及成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。人牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化是正畸中張力側(cè)牙槽骨重塑的重要組成部分。

之前的研究表明，在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的 PDLSCs 成骨分化過程中，活性氧（ROS）水平升高，并誘導(dǎo)核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）及其下游分子如血紅素加氧酶1（HO-1）和醌NADH脫氫酶1（NQO1）的表達(dá)。

Nrf2作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)包括HO1和NQO1在內(nèi)的抗氧化成分的表達(dá)和活性，對(duì)內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)和細(xì)胞防御具有關(guān)鍵作用。許多信號(hào)通路對(duì)于調(diào)節(jié) Nrf2 活性至關(guān)重要，例如蛋白激酶 C（PKC）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和 p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）。

山東大學(xué)口腔醫(yī)院口腔正畸科、山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和山東省口腔生物材料與組織再生工程實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)研究旨在通過基于串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽 (TMT) 的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 分析探索 Nrf2 潛在的循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激成骨分化的機(jī)制，將 Nrf2 激活劑叔丁基對(duì)苯二酚（t-BHQ）應(yīng)用于正畸大鼠，通過免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測(cè)成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平，以證實(shí) Nrf2 可能是改善正畸中牙槽骨重塑的有希望的治療靶點(diǎn)。
 

首先，實(shí)驗(yàn)通過LC-MS/MS 研究了 Nrf2 在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的 PDLSCs 成骨分化中的潛在分子機(jī)制，將PDLSCs在10% 和0.5 hz循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下處理0和12 h。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，162個(gè)蛋白出現(xiàn)差異表達(dá)，其中下調(diào)76個(gè)，上調(diào)86個(gè)。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與了生物過程類別中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸和免疫系統(tǒng)過程。在差異表達(dá)蛋白的KEGG通路富集分析中，PI3K/Akt 信號(hào)通路引起了研究人員的注意，因?yàn)樗��?Nrf2 的激活和易位中起著至關(guān)重要的作用，因此選擇PI3K/Akt信號(hào)通路在后續(xù)研究中進(jìn)一步研究。

接下來，為了確認(rèn)在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化過程中 PI3K/Akt 信號(hào)通路參與 PDLSC 中 Nrf2的激活，基于 KEGG 通路分析，在研究中應(yīng)用了 LY294002。循環(huán)機(jī)械應(yīng)力增加了 Akt的磷酸化（p-Akt），而 PI3K 抑制劑 LY294002 抑制了 p-Akt 的水平（圖1 A）。LY294002下調(diào)Nrf2的mRNA、細(xì)胞質(zhì)和核蛋白表達(dá)水平（圖1 B、C）。

然后測(cè)量了PDLSCs 中有或沒有 LY294002 的情況下，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化能力。數(shù)據(jù)顯示，LY294002抑制成骨相關(guān)標(biāo)志物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白表達(dá)水平（圖1 D、E）。并且LY294002使HO1 的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。上述結(jié)果表明，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的 PDLSCs 成骨細(xì)胞分化中，PI3K/Akt 通路與調(diào)節(jié)Nrf2 表達(dá)有關(guān)。
 

圖1 循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激下的PDLSCs成骨分化過程中，PI3K/Akt信號(hào)通路參與Nrf2激活
 

（A）基于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，PI3K抑制劑LY294002在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下抑制p-Akt水平。（B） LY294002在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下下調(diào)PDLSCs中Nrf2 mRNA水平。（C） LY294002降低了循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下PDLSCs中Nrf2的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和核蛋白表達(dá)水平。 （D） LY294002抑制了循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下PDLSCs中成骨相對(duì)標(biāo)記物（COL1、RUNX2、OPN）和HO1的mRNA水平。（E）LY294002抑制了循環(huán)機(jī)械應(yīng)力下PDLSCs中成骨相對(duì)標(biāo)記物（COL1、RUNX2、OPN）和HO1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。（F）Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，PDLSCs中Akt和Nrf2之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分別與抗Akt抗體和抗Nrf2抗體進(jìn)行免疫沉淀以富集蛋白質(zhì)復(fù)合物。

為了進(jìn)一步證實(shí)在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力過程中，PI3K/Akt 信號(hào)通路在 PDLSCs 中 Nrf2 激活的參與，在隨后的研究中使用了 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Akt 和 Nrf2 之間潛在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能與該過程有關(guān)。用抗 Nrf2 抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)以富集含有 Nrf2 的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后用抗 Akt 抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果表明，Akt存在于含有Nrf2的復(fù)合物中（圖1 F）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化過程中，PI3K/Akt 信號(hào)通路參與了 PDLSCs 中 Nrf2 的激活。

其次，在基于 TMT 的 LC-MS/MS 分析的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，HO1 和 SOD2（Nrf2 的下游抗氧化因子）之間潛在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化有關(guān)。之前的研究表明，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)了 Nrf2 及其下游抗氧化劑 HO1 的表達(dá)。以下研究中評(píng)估了 PDLSCs 中 SOD2 的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，SOD2 的 mRNA 和蛋白表達(dá)在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力過程中上調(diào)（圖2 A-C）。這些數(shù)據(jù)表明，PDLSCs中HO1和SOD2之間的潛在相互作用可能與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨細(xì)胞分化有關(guān)。

為了進(jìn)一步證實(shí)在循環(huán)機(jī)械應(yīng)力過程中HO1和SOD2的相互作用參與PDLSCs，進(jìn)行了Co-IP實(shí)驗(yàn)。用抗 HO1 抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)以富集含有 HO1 的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后用抗 SOD2 抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，數(shù)據(jù)顯示 SOD2 存在于含有 HO1 的復(fù)合物中。根據(jù) Co-IP 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（圖2 D），證實(shí)了HO1和SOD2之間的相互作用與循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化有關(guān)。
 

圖2 循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激下 PDLSCs 中HO1 和 SOD2的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
 

（A）循環(huán)機(jī)械應(yīng)力期間PDLSCs中SOD2的免疫熒光染色。（B）根據(jù)RT-PCR的結(jié)果，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力上調(diào)PDLSCs中SOD2 mRNA的表達(dá)。（C）根據(jù)蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果，循環(huán)機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)了SOD2蛋白在PDLSCs中的表達(dá)。（D）Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，PDLSCs中HO1和SOD2之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分別作為抗HO1抗體和抗SOD2抗體的免疫沉淀來富集蛋白質(zhì)復(fù)合物。

之前的研究表明，Nrf2 對(duì)循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨細(xì)胞分化具有積極作用。最后為了驗(yàn)證 Nrf2 可能是正畸治療中一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)將 t-BHQ、Nrf2 激活劑和 FDA 批準(zhǔn)的食品添加劑應(yīng)用于正畸大鼠，通過IHC染色檢測(cè)PDL中成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平。結(jié)果表明，T-BHQ可促進(jìn)正畸大鼠張力側(cè)PDL中Nrf2及其下游抗氧化劑HO1的表達(dá)。t-BHQ 處理正畸大鼠中 ALP 和 COL1（成骨相關(guān)標(biāo)志物）的表達(dá)水平上調(diào)。這些結(jié)果表明，Nrf2 可能是有希望的治療干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)正畸中的牙槽骨重塑具有積極作用。

總之，Nrf2 激活通過 PI3K/Akt 通路和 HO1-SOD2 相互作用參與 PDLSCs 中循環(huán)機(jī)械應(yīng)力刺激的成骨分化。Nrf2 激活劑 T-BHQ 增強(qiáng)了正畸大鼠張力側(cè)成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平。Nrf2可能是改善正畸治療中牙槽骨重塑的潛在且有希望的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Xi X, Li Z, Liu H, Chen S, Liu D. Nrf2 Activation Is Involved in Cyclic Mechanical Stress-Stimulated Osteogenic Differentiation in Periodontal Ligament Stem Cells via PI3K/Akt Signaling and HO1-SOD2 Interaction. Front Cell Dev Biol. 2022 Jan 6;9:816000. doi: 10.3389/fcell.2021.816000. PMID: 35071244; PMCID: PMC8770743.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35071244/

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