HPLC－MS/MS法在檢測大鼠乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺濃度的應(yīng)用

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide）是臨床上最常用的一種烷化劑類抗腫瘤藥，廣泛用于治療惡性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等，具有一定的化療效果。環(huán)磷酰胺是一個典型的前體藥物，體外無活性，在肝中被細(xì)胞色素P450氧化酶氧化，生成活化型的磷酞胺氮芥發(fā)揮抗腫瘤作用，屬細(xì)胞周期非特異性藥物。目前，國內(nèi)環(huán)磷酰胺血漿濃度的測定方法主要是GC法和 HPLC法，但耗時較長，檢測限偏高。此外，血藥濃度結(jié)果不能準(zhǔn)確反映靶標(biāo)部位的治療情況。微透析技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新型活體靶標(biāo)取樣技術(shù)。本研究旨在建立HPLC－MS法測定大鼠乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺的濃度。

微透析技術(shù)可監(jiān)測靶部位組織細(xì)胞外的游離藥物濃度，因此，監(jiān)測組織中藥物的濃度比傳統(tǒng)血藥濃度的定量結(jié)果更具預(yù)測性。本次實(shí)驗(yàn)微透析系統(tǒng)包括CMA150型動物保溫墊、CMA402型微量注射泵、MAB85型低溫樣品收集器、CMA30型線性微透析探針（分子截留值６KU，透析膜長１CM），均購自美國CMA公司。

微透析樣品收集及處理

1、探針體外校正　

以林格氏液沖洗探針后，將線性微透析探針浸入裝有100ｍｌ林格氏液的微透析反應(yīng)瓶中，分別以不用濃度的藥物（cin,1.0、0.4、0.8μg/ml）作為灌流液，其他條件不變，收集的樣品在所建立的HPLC－MS/MS條件下測定透析液中藥物濃度。通過減量法計算環(huán)磷酰胺的體外探針回收率,Ｒ=（cin－cout）/cin，結(jié)果為（53.32±1.23）％。

2、微透析樣品收集　

大鼠用水合氯醛按體重（0.4ml/100ｇ,ip）麻醉，腹部朝上固定于保溫墊上，使其體溫保持在37.5℃。用脫毛膏去除胸部毛，15min后，暴露大鼠乳頭，用直尺準(zhǔn)確量取探針透析膜進(jìn)出的長度。將線性微透析探針用18Ｇ 穿刺針引導(dǎo)平行植入乳腺組織后，抽回引導(dǎo)針并將探針留于組織中，然后將探針與微透析裝置相連。以2μl/ml的流速向其中泵入林格氏液作為灌流液，排除氣泡并沖洗管路30min，再以1.0μl/ml的流速向微透析探針中泵入林格氏液，平衡１ｈ后，收集空白透析液。將注射用環(huán)磷酰胺用生理鹽水溶解，尾靜脈注射給藥，一次性給予0.20mg/g。以冷凍樣品收集器連續(xù)收集透析液，采樣間隔30min，溫度4℃，持續(xù)采樣2ｈ。

3、樣品處理

精密量取透析液樣品20μｌ，加入內(nèi)標(biāo)溶液10μｌ，渦旋10ｓ，進(jìn)樣2μｌ。

圖１�。龋校蹋茫�ＭＳ／ＭＳ法測定大鼠乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺和內(nèi)標(biāo)安替比林的典型譜圖

Ａ：空白透析液；Ｂ：空白透析液＋環(huán)磷酰胺對照品（0.1μｇ/ｍｌ）＋內(nèi)標(biāo)安替比林（1.0μｇ/ｍｌ）；Ｃ：微透析液樣品；Ａ１、Ｂ１、Ｃ１：環(huán)磷酰胺；Ａ２、Ｂ２、Ｃ２：安替比林

微透析樣品中環(huán)磷酰胺的精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

文獻(xiàn)報道，環(huán)磷酰胺普遍應(yīng)用于乳腺癌聯(lián)合治療方案中，在乳腺癌化療過程中占據(jù)著不可忽視的地位。因此，本研究采用HPLC－MS/MS法檢測乳腺微透析液中環(huán)磷酰胺的藥物濃度，方法專屬性強(qiáng)，檢測限低，檢測時間短，可在８min內(nèi)快速檢測出乳腺中環(huán)磷酰胺的藥物濃度，提供了一種快速有效監(jiān)測環(huán)磷酰胺藥物濃度的方法。

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