外泌體純不純，一聞就知
以外泌體為基礎(chǔ)的細胞間通訊橫跨所有生命領(lǐng)域。多項研究表明，與傳統(tǒng)的合成載體相比，外泌體在藥物遞送方面具有若干優(yōu)勢，為現(xiàn)代藥物輸送開辟了新領(lǐng)域，使得外泌體近年來備受科研、產(chǎn)業(yè)界乃至資本市場的關(guān)注。但是以外泌體為基礎(chǔ)的治療的臨床轉(zhuǎn)化仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。其中，如何精準且快速地實現(xiàn)外泌體治療制劑的質(zhì)量控制成為外泌體產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域目前亟需解決的一項問題。2022年5月10日，國家發(fā)展改革委印發(fā)《“十四五”生物經(jīng)濟發(fā)展規(guī)劃》（以下簡稱《規(guī)劃》）�！兑�(guī)劃》明確指出需建設(shè)外泌體治療產(chǎn)品等新型治療制劑及方案的質(zhì)量及安全性評價技術(shù)平臺。
外泌體來源環(huán)境復(fù)雜，其中往往存在大量脂蛋白、蛋白團聚體及其他非囊泡組分。高純度外泌體的分離制備成為高質(zhì)量外泌體制劑研發(fā)和生產(chǎn)的先決條件。但是由于外泌體不僅個體極其微小，攜載的蛋白、核酸、脂類等“貨物分子”含量極低，而且因來源細胞、細胞狀態(tài)以及分泌途徑的不同使得外泌體在尺寸、膜蛋白和內(nèi)含物等方面存在高度的個體差異性和多樣性。這些固有因素提出了在單顆粒水平對外泌體質(zhì)量評估的這一重要需求。
傳統(tǒng)表征方案
i. 至少3個外泌體標志蛋白（膜表面蛋白以及內(nèi)腔蛋白）
ii. 至少一個陰性蛋白
i.電鏡成像
ii.其他非電鏡的單顆粒表征平臺
此外，目前尚且沒有關(guān)于工業(yè)生產(chǎn)外泌體的統(tǒng)一質(zhì)量評估標準。因此，探索和確立適用于外泌體相關(guān)治療產(chǎn)品的質(zhì)控標準，將極大推動這一領(lǐng)域發(fā)展。
外泌體產(chǎn)品的多維度質(zhì)量控制從外泌體的結(jié)構(gòu)和組成出發(fā)，針對粒徑、濃度和純度等物理參數(shù)以及蛋白、核酸等生化指標，NanoFCM提出如下（圖1）質(zhì)量控制建議。
圖1. 單EV水平的質(zhì)量控制方法
圖2. 單外泌體水平的粒徑及濃度表征（左）稀釋性測試（右）
圖3. NanoFCM散射性能和稀釋線性
(2) Triton X-100測定純度
Triton X-100是一種表面活性劑，可裂解外泌體的膜結(jié)構(gòu)。可通過對比裂解前后外泌體樣品的顆粒數(shù)變化，得到外泌體樣本純度。如圖4所示，經(jīng)Triton X-100處理，該外泌體樣品中顆粒數(shù)目明顯下降，計算可得該外泌體樣品純度為66.0%。
圖4. 基于Triton X-100膜處理的外泌體純度檢測
(3) 膜染料測定純度
公司自主開發(fā)的膜染料可實現(xiàn)對外泌體樣品中含有膜結(jié)構(gòu)的顆粒的標記，從而實現(xiàn)樣本純度分析。如圖5所示，經(jīng)綠色熒光脂膜染料染色，該樣本中79.5%的顆粒因具有膜結(jié)構(gòu)而被該脂膜染料標記，且熒光強度與顆粒粒徑呈現(xiàn)正相關(guān)。該膜染料不與膜結(jié)構(gòu)結(jié)合時無本底熒光信號，嵌入脂膜后熒光信號大大增強，因此無需去除游離染料，與傳統(tǒng)膜染料相比使用更為便捷。
近年來，基于外泌體核酸的疾病診斷和治療的相關(guān)研究呈現(xiàn)井噴式發(fā)展。通過核酸染料標記的方式可以實現(xiàn)外泌體上核酸的定位分析，包括內(nèi)部、表面和游離狀態(tài)的核酸，對核酸的豐度和狀態(tài)進行綜合分析。
結(jié)合SYTO 16核酸染料標記及酶處理策略，利用NanoFCM對外泌體中DNA分子的存在形式及分布特征在單顆粒水平進行了詳細分析（圖7），外泌體運載的DNA分子主要為dsDNA；外部粘附DNA的外泌體粒徑相對較小，而內(nèi)部包裹DNA的外泌體粒徑相對較大；經(jīng)超速離心和SEC方法制備的外泌體樣本中存在著大量與囊泡顆粒不相關(guān)的游離DNA分子。
NanoFCM除了可實現(xiàn)基于以上多種方法的外泌體質(zhì)量控制，在載藥效率、配體修飾水平等方向亦可實現(xiàn)快速精確檢測，為外泌體臨床科研及產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展提供助力。如您需要以上相關(guān)檢測方案或申請樣機試用，可掃描下方客服微信二維碼聯(lián)系我們。
參考文獻
1.Tian Y et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nanoflow cytometry[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2020, 9, 1697028
2.Tian Y et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry[J]. ACS Nano, 2018, 12(1): 671-680.
3.Liu H et al. Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2022, 11, e12206
4.Niu Q et al . Quantitative Characterization of Purity, Concentration and Size Distribution of Bacterial Membrane Vesicles at Single-Particle Level. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2021, 49(5): 733-742.
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