DNMT3A突變小鼠模型助力揭示衰老相關(guān)克隆性造血分子的機(jī)制

克隆性造血屬于血液腫瘤的癌前病變狀態(tài)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，克隆性造血會(huì)隨著個(gè)體的衰老而不斷加劇，因而也被稱為衰老相關(guān)克隆性造血。克隆性造血的個(gè)體發(fā)生白血病的風(fēng)險(xiǎn)較正常人增加了10倍，并出現(xiàn)髓系細(xì)胞分化偏向性，從而導(dǎo)致系統(tǒng)性慢性炎癥，進(jìn)而使得炎癥相關(guān)疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死以及中風(fēng)的發(fā)生率提高了約1倍^[1-3]。而全身性的慢性炎癥反過來(lái)加劇克隆性造血的進(jìn)展，從而形成一個(gè)惡性循環(huán)（圖1）。

克隆性造血發(fā)生率隨著年齡增大而增加，并伴隨著很多關(guān)鍵基因的突變，其中DNMT3A在多個(gè)研究中都顯示為突變頻率最高的基因^[4]。DNMT3A可測(cè)到的突變位點(diǎn)多達(dá)190個(gè)，其中R882位點(diǎn)突變?cè)诳寺⌒栽煅獋�(gè)體中占17%，在急性髓系白血�。ˋML）個(gè)體中占比高達(dá)50%^[5]。由于克隆性造血為白血病的癌前病變狀態(tài)，由此說(shuō)明攜帶R882突變的克隆性造血患者更容易轉(zhuǎn)化為白血病^[6,7]。那么，DNMT3A突變頻率隨著衰老不斷增加的分子機(jī)制尚不明確。
 

圖1 克隆性造血、慢性炎癥和心管疾病之間的聯(lián)系
 

研究材料
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了Dnmt3a^fl-R878H/+小鼠（由賽業(yè)生物提供）、Vav-iCre小鼠、Mlkl^-/-小鼠、Ripk1^K45A小鼠、Ripk3^Δ/Δ小鼠、CD45.1小鼠以及CD45.1/2小鼠。

技術(shù)方法
本項(xiàng)研究主要采用了流式分析、流式分選、全骨髓競(jìng)爭(zhēng)移植、LPS炎癥模型、體外培養(yǎng)造血干及祖細(xì)胞、細(xì)胞因子芯片檢測(cè)、蛋白質(zhì)印跡以及實(shí)時(shí)定量PCR研究方法。

技術(shù)路線
 

研究結(jié)果

1.衰老的骨髓促進(jìn)DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
研究者從年輕的R878H小鼠（即Dnmt3a^fl-R878H/+, Vav-icre⁺，其中Dnmt3a^fl-R878H/+小鼠由賽業(yè)生物提供，通過ES打靶技術(shù)構(gòu)建）中提取骨髓細(xì)胞，連同正常的競(jìng)爭(zhēng)者骨髓細(xì)胞移植到年輕與年老的受體小鼠中。結(jié)果顯示，R878H骨髓細(xì)胞在年老受體小鼠中重建率更高，而WT細(xì)胞則沒有明顯差異（圖2），說(shuō)明年老的骨髓微環(huán)境促進(jìn)了R878H誘導(dǎo)的克隆性造血。那么到底是年老骨髓中什么因素促進(jìn)了R878H細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增呢？
 

圖2 衰老的骨髓促進(jìn)DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血

2.LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進(jìn)R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
近些年來(lái)，普遍認(rèn)為衰老與炎癥密切相關(guān)，因此有了炎性衰老（Inflamm-aging）的概念。那么，R878H細(xì)胞在年老骨髓中的克隆性擴(kuò)增是否與年老的骨髓炎癥微環(huán)境增強(qiáng)相關(guān)呢？為此，研究者分別用LPS模擬急性和慢性炎癥刺激。發(fā)現(xiàn)R878H HSC對(duì)于急性炎癥刺激的響應(yīng)明顯下降，而慢性炎癥刺激可以促進(jìn)R878H細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的克隆性造血（圖3）。
 

圖3 LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進(jìn)R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血

3.R878H HSC抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷
研究者分別取年輕和年老受體小鼠的骨髓上清做細(xì)胞因子芯片分析，發(fā)現(xiàn)其中TNFα信號(hào)通路在年老骨髓中顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H HSC可以抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷（圖4），證明TNFα是年老骨髓微環(huán)境中促進(jìn)R878H細(xì)胞克隆性擴(kuò)增的主要炎癥因子。
 

圖4 R878H HSC抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

4.Dnmt3a R878H細(xì)胞抵抗細(xì)胞程序性壞死激活
研究者將年老受體骨髓中的LSK細(xì)胞分選出來(lái)做RT-PCR，分別檢測(cè)TNFα信號(hào)下游相關(guān)的通路基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凋亡通路的Fadd和Caspase-8以及細(xì)胞程序性壞死通路的Ripk1和Ripk3表達(dá)下降（圖5），說(shuō)明凋亡和程序性壞死通路在R878H細(xì)胞中受到了抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H細(xì)胞能夠部分抵抗細(xì)胞程序性壞死，而不是凋亡（圖5），說(shuō)明Dnmt3a R878H細(xì)胞通過抵抗細(xì)胞程序性壞死的激活而獲得增殖優(yōu)勢(shì)。

圖5 Dnmt3a R878H細(xì)胞抵抗細(xì)胞程序性壞死激活

研究結(jié)論
在這項(xiàng)研究中，研究者利用造血干細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性移植和LPS誘導(dǎo)的炎癥模型來(lái)檢測(cè)炎癥和衰老微環(huán)境對(duì)DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血的作用，觀察到R878H骨髓細(xì)胞在衰老的骨髓微環(huán)境和炎癥侵襲時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的重建能力，發(fā)現(xiàn)R878H造血干及祖細(xì)胞通過抵抗由TNFα誘導(dǎo)、RIPK1–RIPK3–MLKL介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死而促進(jìn)R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血，而衰老上調(diào)的炎癥信號(hào)（主要為TNFα信號(hào)）可以加速這一過程（圖6）。

該研究系統(tǒng)性地從DNMT3A R878H小鼠模型的構(gòu)建，到DNMT3A R882突變引發(fā)衰老相關(guān)克隆性造血的機(jī)制研究，解析了衰老進(jìn)程中DNMT3A hR882H/mR878H突變導(dǎo)致造血干細(xì)胞克隆性增生的分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)DNMT3A突變及其他相關(guān)突變驅(qū)動(dòng)的克隆性造血及白血病研究具有一定的指導(dǎo)意義。
 

圖6 Dnmt3a R878H驅(qū)動(dòng)克隆性造血模型

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原文檢索：

MinLiao, RuiqingChen, YangYang, et al. Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 12, Issue 2, February 2022, Pages 678-691.https://doi.org/10.1016/j.apsb.2021.09.015