naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在檢測(cè)西瓜種質(zhì)間CITST2基因差異的應(yīng)用

導(dǎo)讀

西瓜 (Citrullus lanatus, 2n=22)是世界第三大水果，是世界各地種植的重要經(jīng)濟(jì)作物，也是一種受歡迎的新鮮水果，含有糖、番茄紅素和瓜氨酸等有益人體健康的化合物。研究人員通過(guò)雜交開(kāi)發(fā)了大量西瓜品種以滿(mǎn)足消費(fèi)者的偏好。但長(zhǎng)期栽培和對(duì)果實(shí)品質(zhì)性狀的篩選，不同地理區(qū)域采集的栽培西瓜顯示出較低的遺傳多樣性，因此需要更多的遺傳種質(zhì)資源用于可持續(xù)生產(chǎn)西瓜的創(chuàng)新品種。

參考基因組對(duì)于性狀和基因發(fā)現(xiàn)是必不可少的。西瓜基因組測(cè)序工作始于十幾年前。除西瓜基因組初稿外，自2019年以來(lái)已經(jīng)發(fā)布了三個(gè)高質(zhì)量的西瓜參考基因組。然而，每個(gè)基因組仍然不完整，存在許多空白。高質(zhì)量的參考基因組與從相同遺傳庫(kù)產(chǎn)生的突變體數(shù)據(jù)相結(jié)合，將有助于發(fā)現(xiàn)和分離遺傳和育種所需的突變體。無(wú)缺口參考基因組是基因組組裝的最終目標(biāo)，為識(shí)別“暗物質(zhì)”區(qū)域中的獨(dú)特基因和結(jié)構(gòu)變異帶來(lái)了新的機(jī)會(huì)。

北京大學(xué)高等農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所科研人員在Molecular Plant（最新JCR分區(qū)Q1，影響因子21.9496）上發(fā)表了題為《A telomere-to-telomere gap-free reference genome of watermelon and its mutation library provide important resources for gene discovery and breeding》的文章。研究者使用西瓜優(yōu)良近交系G42組裝了一個(gè)T2T（telomere-to-telomere）無(wú)缺口參考基因組，彌補(bǔ)了當(dāng)前可用參考基因組中所有剩余的組裝缺口。通過(guò)基因組信息比對(duì)識(shí)別了甜西瓜種質(zhì)中一個(gè)包含ClTST2（液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）基因的17.5 kb串聯(lián)重復(fù)序列(sv04611)。該研究應(yīng)用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)西瓜CITST2基因的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)了不同西瓜種質(zhì)之間CITST2基因拷貝數(shù)存在差異，甜西瓜種質(zhì)中CITST2基因的拷貝數(shù)增加可能是造成糖含量增加的原因。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)甜西瓜和不甜西瓜種質(zhì)之間CITST2基因拷貝數(shù)的差異進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

▶ 甜西瓜和不甜西瓜種質(zhì)中CITST2基因分別為兩個(gè)拷貝和單個(gè)拷貝。

▶ CITST2基因的拷貝數(shù)變異可能會(huì)改變西瓜糖含量。

G42基因組組裝比其他參考基因組組裝具有更高的完整性和準(zhǔn)確性，為更準(zhǔn)確地描述基因結(jié)構(gòu)變異（SVs）提供了更多的數(shù)據(jù)支撐。數(shù)字PCR技術(shù)已被證明可以靈敏可靠地檢測(cè)拷貝數(shù)變異的核酸絕對(duì)定量工具。該研究采用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)精確定量不同西瓜種質(zhì)之間CITST2基因拷貝數(shù)的差異，驗(yàn)證了無(wú)缺口參考基因組識(shí)別SVs的準(zhǔn)確性。

研究成果：

本研究成功組裝出G42 西瓜的T2T無(wú)缺口參考參考基因組，包括所有22個(gè)端粒和11個(gè)著絲粒的信息。利用無(wú)缺口參考基因組數(shù)據(jù)，研究者識(shí)別了甜西瓜種質(zhì)（97103和G42）sv04986結(jié)構(gòu)中一個(gè)包含ClTST2基因的17.5 kb串聯(lián)重復(fù)序列(sv04611)。這是不甜西瓜種質(zhì)（PI 595203和PI 296341-FR）基因組中不存在的。ClTST2基因編碼一種定位于液泡的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其表達(dá)與西瓜果肉中的糖積累呈正相關(guān)。

▲圖1. (A)sv04986 結(jié)構(gòu)在甜西瓜（97103和 G42）和不甜西瓜（PI 595203和PI 296341-FR）種質(zhì)中含有 ClTST2 基因。甜西瓜種質(zhì)中存在一個(gè)17.5kb的串聯(lián)重復(fù)序列sv04611，包含2bp的CA插入突變。紅色箭頭代表引物 ClTST2-R8/ClTST2-F3的位置。(B)使用ClTST2-R8/ ClTST2 -F3 引物擴(kuò)增四個(gè)西瓜種質(zhì)DNA 樣本的結(jié)果。

隨后作者使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)甜西瓜和非甜西瓜種質(zhì)之間CITST2基因拷貝數(shù)的差異進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。FAM通道僅能檢測(cè)到存在CA插入突變的區(qū)域。HEX通道用于檢測(cè)ClTST2基因。CY5通道檢測(cè)的是西瓜中的單拷貝內(nèi)參基因Actin。當(dāng)CITST2基因?yàn)殡p拷貝時(shí)，F(xiàn)AM/HEX/CY5拷貝數(shù)比約為1:2:1。當(dāng)CITST2基因?yàn)閱慰截悤r(shí)，F(xiàn)AM/HEX/CY5拷貝數(shù)比約為0:1:1。數(shù)據(jù)顯示兩個(gè)不甜西瓜的種質(zhì)僅包含單拷貝CITST2基因，而甜西瓜種質(zhì)在包含兩個(gè)拷貝CITST2基因。

▲表1.利用dPCR技術(shù)估算甜和不甜西瓜種質(zhì)中CITST2基因拷貝數(shù)

原文鏈接如下：https://www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(22)00192-7?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS1674205222001927%3Fshowall%3Dtrue

期刊介紹：

Molecular Plant (《分子植物》)是由中科院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所（IPPE）與中國(guó)植物生理與植物分子生物學(xué)學(xué)會(huì)（CSPP）主辦，中科院上海生命科學(xué)信息中心生命科學(xué)期刊社承辦的學(xué)術(shù)期刊，創(chuàng)刊于2008年。2022最新JCR分區(qū)Q1，影響因子21.9496。