液相色譜中色譜柱異常與解決辦法及經(jīng)驗分享

　色譜柱異常與解決方法

　　柱壓與硅膠基質(zhì)的形態(tài)(如無定形或球形硅膠)、顆粒大小、填料合成條件、裝柱條件、所用流動相和分析時的溫度有關(guān)。

　　不同廠家的色譜柱柱壓會有所差別，相同流動相和溫度的條件下，不同廠家的新色譜柱有的柱壓可能相差4、5個MPa，特別是低端和高性能色譜柱之間，這一區(qū)別比較明顯。這是由色譜柱廠家所選用的硅膠基質(zhì)及其生產(chǎn)條件決定的，這種差異的存在是正常的。

　　同時需要說明的一點是，柱壓與柱效有一定的關(guān)系，通常柱效高的色譜柱柱壓相對而言會高一點，但柱壓高的色譜柱并不一定就具有高柱效。

　　在色譜柱的使用過程中柱壓通常會出現(xiàn)兩種升高的形式：

　　第一種是，隨著使用時間的延長色譜柱柱壓慢慢上升，這是正常的;

　　第二種是，使用過程中(流動相和溫度沒有改變的條件下)色譜柱壓力突然升高很多。這種壓力突然升高的現(xiàn)象，通常是由工作人員操作不當引起的。

　　原因：

　　樣品太臟，使用前沒有過濾，導致柱篩板堵塞;

　　樣品含有的雜質(zhì)在流動相中的溶解性不是很好，與流動相混合后析出，導致柱塞板堵塞;

　　使用緩沖鹽，處理錯誤，緩沖鹽在色譜柱中析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙。

　　解決辦法對于第二種，即柱壓突然升高的情況，通常有以下幾種解決辦法：

　　將色譜柱反接，用含水比例較大的流動相進行沖洗。

　　色譜柱進樣一端的篩板取下，分別放在水中和甲醇中超聲或更換新的柱篩板。如果柱效沒變，但柱壓仍然較高，則應考慮進樣端填料受污染的問題，因此除了取下進樣端篩板超聲外，還需要挖掉進樣端的部分填料，挖去填料之前先檢查一下填料的顏色，如果填料的顏色發(fā)生了變化，則應該挖掉直到見到白色的填料為止。

　　挖掉后色譜柱將出現(xiàn)一個缺口，填補缺口的填料可以從另一支相同品牌、相同型號的報廢色譜柱的出口端獲得，填料用有機溶劑如甲醇等調(diào)成糊狀裝入缺口處，壓緊刮平，再裝上篩板。

　　
色譜柱使用經(jīng)驗

　　色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。

　　但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。

　　1. 樣品的前處理

　　a. 最好使用流動相溶解樣品。

　　b. 使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。

　　c. 使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

　　2. 流動相的配制

　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

　　流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。

　　流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學反應(特殊情況除外)。

　　流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果;同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

　　流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

　　流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進行。

　　在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

　　3. 流動相流速的選擇

　　因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。

　　對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。當選用最佳流速時，分析時間可能延長�？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

　　注意

　　由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。

　　對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。

　　含水流動相最*在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好加入三氮化鈉，防止細菌生長。

　　流動相要求使用0.45 µm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

　　使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

　　沖柱子的目的

　　只要是有機溶劑就行，不過黏度不要太大，因為有機溶劑能夠防止細菌生長，沖柱子的目的就是為了防止細菌生長堵塞儀器系統(tǒng)和柱子。一般甲醇和乙腈相互沖洗是沒有問題的，但乙腈要比甲醇價格貴的。

　　保留時間變化的原因

　柱頭塌陷

　　在使用過程中，填料下沉，在柱子進口處出現(xiàn)一個小空間，使得分離效果不良。

　　補救方法：卸開柱頭螺絲，找一點同類填料，用甲醇濕潤后，添在柱子上，反復幾次。然后裝上螺絲，用溶劑沖洗1-2小時，使之平衡。

　　小結(jié)

　　正確使用緩沖鹽很有必要，既可以防止緩沖鹽析出，也可以達到提高色譜柱使用壽命的目的。我們不妨用一句話來總結(jié)它的使用方法：用前要過濾，用后需沖洗。