應(yīng)用Creb1基因編輯小鼠研究神經(jīng)系統(tǒng)及肌肉再生的關(guān)鍵基因

環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB1（cAMP responsive element binding protein1）屬于DNA蛋白結(jié)合類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子超家族，主要與cAMP等信號發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)。Creb1基因編輯模型目前已應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、肌肉的研究。

賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周五更新，為大家講解一個小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是Creb1基因編輯小鼠。

Creb1基因簡介
Creb1基因位于小鼠的1號染色體上，該基因參細(xì)胞對維甲酸的反應(yīng)、生物合成過程的正向調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，同時在動物器官發(fā)育、細(xì)胞對肝細(xì)胞生長因子刺激反應(yīng)以及細(xì)胞對白血病抑制因子反應(yīng)過程的上游或內(nèi)部起作用。Creb1基因?qū)崿F(xiàn)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶II特異性和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合活性。

Creb蛋白是Creb1基因轉(zhuǎn)錄翻譯而來，通過可變剪切方式，形成多種剪接體：Crebα、Crebβ和Crebб等。Creb蛋白是磷酸化依賴性轉(zhuǎn)錄因子，在與CRE（cAMP response element，CRE）結(jié)合后刺激轉(zhuǎn)錄。該序列存在于許多病毒和細(xì)胞的啟動子中，參與不同的細(xì)胞過程，包括脂肪細(xì)胞的分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡及一些與生命活動有關(guān)因子的生成等，從而參與細(xì)胞的發(fā)育與生存、機體的生長發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、防御反應(yīng)等生命活動。同時，Creb蛋白是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，參與神經(jīng)保護(hù)與神經(jīng)發(fā)育。其在幾個結(jié)構(gòu)中表達(dá)，包括泌尿生殖系統(tǒng)、肢體、上頜骨過程、周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)、端腦等。
 

Creb1基因編輯小鼠模型
1.神經(jīng)系統(tǒng)
神經(jīng)元凋亡波對于塑造發(fā)育中大腦的復(fù)雜結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，而進(jìn)行性、區(qū)域性神經(jīng)元喪失是成人大腦中各種神經(jīng)退行性疾病不可逆發(fā)病機制的基礎(chǔ)。在發(fā)育過程中，神經(jīng)元存活或死亡之間的決定取決于獲得神經(jīng)營養(yǎng)支持和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體的激活。這兩個事件都激活了最終保護(hù)神經(jīng)元免于凋亡細(xì)胞死亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。抗凋亡信號通過各種機制（包括基因表達(dá)的調(diào)節(jié)）對細(xì)胞存活產(chǎn)生影響。神經(jīng)營養(yǎng)因子和活性依賴性基因表達(dá)由幾種神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)介導(dǎo)，例如PI3K/Akt通路、MAPK通路、Ca2+/CaMK和cAMP/PKA通路，這些通路匯聚在亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子的Creb家族上[1]。該轉(zhuǎn)錄因子家族由Creb、相關(guān)蛋白cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)蛋白（CREM）和激活轉(zhuǎn)錄因子1（ATF1）組成。三者均被磷酸化激活，并以同源或異源二聚體的形式與靶基因啟動子中的cAMP反應(yīng)元件（CRE）結(jié)合。
 

圖2 Creb1基因的敲除方案策略[2]

為了獲得神經(jīng)系統(tǒng)特異性的Creb突變小鼠，研究者在ES細(xì)胞中使用同源重組對Creb1等位基因進(jìn)行修飾，使編碼bZIP結(jié)構(gòu)域第一部分的Creb1第10外顯子的兩側(cè)位于loxP位點。Cre介導(dǎo)的Creb1loxP等位基因的重組導(dǎo)致一個Creb1空等位基因，該基因編碼一個截斷的Creb蛋白，沒有DNA結(jié)合和二聚結(jié)構(gòu)域，這種被截斷的蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的，因此成功的重組會導(dǎo)致Creb的丟失。

接下來研究人員對Creb1NescreCrem-/-小鼠的大腦發(fā)育進(jìn)行考察，在E16.5、E18.5和P0的Creb1NescreCrem-/-腦中存在所有腦結(jié)構(gòu)，表明Creb和CREM在腦形成中沒有主要作用。而組織學(xué)分析顯示在E18.5和P0時整個大腦的細(xì)胞密度降低，伴隨著固縮核和擴大的腦室的細(xì)胞增。這些顯著性的變化在P0期大腦中更為廣泛，表明在這段時間內(nèi)細(xì)胞死亡的積累或加速。在突變P0大腦高度受影響的皮質(zhì)區(qū)，皮質(zhì)板完全紊亂，在松散排列松散的小圓形細(xì)胞簇中只能發(fā)現(xiàn)少量錐體細(xì)胞。上述結(jié)果表明，缺乏Creb和Crem的小鼠大腦中的細(xì)胞完整性受到損害。
 

圖3 腦切片的組織學(xué)分析[2]
 

a-b：Creb1NescreCrem+/-和Creb1NescreCrem-/-腦切片的組織學(xué)分析；c-h：比較Nissl染色顯示，突變小鼠的神經(jīng)元大量丟失，細(xì)胞核固縮的細(xì)胞數(shù)量增加，特別是在皮質(zhì)板（c，d）和海馬CA1區(qū)（e，f）。丘腦或下丘腦也受到影響（g、h），但影響程度較輕。i-j：在嗅球中，二尖瓣細(xì)胞層明顯減少。

為了檢查神經(jīng)元數(shù)量的減少是否是由于細(xì)胞退化增加、增殖減少或兩者兼而有之，研究人員用Ki-67和TUNEL標(biāo)記細(xì)胞，并在突變體和對照腦中對活化的caspase 3進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，在大腦所有區(qū)域都發(fā)生了不同程度的細(xì)胞凋亡，Creb1NescreCrem-/-、Creb1Nescre、Crem-/-和Creb1NescreCrem+/-顯示凋亡控制水平，進(jìn)一步支持神經(jīng)元死亡和Creb和CREM缺失之間的聯(lián)系。
 

圖4 在大腦中同時缺乏Creb和CREM的小鼠中，細(xì)胞增殖正常，但神經(jīng)元死亡增加[2]
 

a-c：Creb1loxP/loxPCrem+/-、Creb1NescreCrem+/-與Creb1NescreCrem-/-小鼠的心室區(qū)增殖活性。d-i：與對照組小鼠（d，e，g，h）相比，突變體的第VI層和第V層的細(xì)胞表現(xiàn)出強烈的TUNEL標(biāo)記（f）和激活的caspase 3染色（i）。

以上結(jié)果表明，Creb家族成員對體內(nèi)神經(jīng)元存活至關(guān)重要。發(fā)育中的大腦中缺乏Creb和CREM會導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞死亡，而由Creb或CREM介導(dǎo)的出生后轉(zhuǎn)錄中斷會觸發(fā)選擇性和進(jìn)行性神經(jīng)變性�？傊�，這項研究表明Creb和CREM對于維持體內(nèi)神經(jīng)元存活至關(guān)重要，提高了Creb信號通路的藥理學(xué)操作可能對神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展后的功能和解剖學(xué)惡化產(chǎn)生積極治療作用的可能性。

2.肌肉再生
脊椎動物的肌生成受肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子的級聯(lián)控制，這些轉(zhuǎn)錄因子決定了肌原性規(guī)范和分化，以及受損成人骨骼肌的修復(fù)。第二信使cAMP和cAMP反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子Creb在肌生成過程中受到時間調(diào)節(jié)，是小鼠胚胎體細(xì)胞發(fā)育所必需的，其在胚胎骨骼肌祖細(xì)胞的分化和成體骨骼肌的存活中起關(guān)鍵作用[3]。Creb的基因缺失或顯性Creb抑制劑A-Creb的表達(dá)會損害小鼠的肌肉組發(fā)育，可能是通過調(diào)節(jié)肌生成調(diào)節(jié)因子Pax3和Myf5。此外，A-Creb在成熟肌纖維中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)會導(dǎo)致肌肉變性。Creb也被證明在肌原性分化過程中調(diào)節(jié)RB和卵泡抑素的轉(zhuǎn)錄，這表明Creb參與了肌發(fā)生過程中的末端細(xì)胞周期阻滯和融合[4]。上述研究表明，Creb是肌肉分化和存活的多個階段的重要調(diào)控因子。
 

圖5 Creb1基因編輯方案策略[5]
 

為了探討關(guān)于激活正常肌肉中Creb的生理信號，研究人員從包含小鼠Creb1外顯子3-5的10.5kb基因組片段構(gòu)建靶向載體。使用定點誘變引入Y134F突變。Creb+/YF小鼠與C57BL/6回交10代以獲得Creb+/+和CrebYF/YF小鼠。同時，為了表征Creb在骨骼肌再生中的作用，研究人員將心臟毒素注射到小鼠腓腸肌中，注射心臟毒素后，骨骼肌的退化和再生是通過肌纖維壞死、衛(wèi)星細(xì)胞活化和分化、成肌細(xì)胞增殖和遷移以及最終肌纖維再生的特征明確的過程發(fā)生的。結(jié)果表明，Creb被激活以響應(yīng)肌肉損傷。
 

圖6 Creb由肌肉損傷激活[5]

A.注射心臟毒素（CTX）后3天，未受傷和受傷的對側(cè)肌肉對抗pCreb（S133）抗體免疫組化；B.CTX注射后3天，小鼠腓腸肌中Creb靶基因mrnaSik1和Nr4a2；C.用Nr4a2反義核糖體探針在未損傷和3天CTX注射的對側(cè)腿上進(jìn)行原位雜交；D.在4周齡Dmdmdx小鼠腓腸肌上的磷酸化-Creb免疫組化和npc；E.4周齡小鼠腓腸肌野生型和Dmdmdx腓腸肌組織中的Sik1 mRNA；F.4周齡時，用反義Nr4a2核糖體探針或空白（對照）對Dmdmdx腓腸肌進(jìn)行原位雜交；G.腓腸肌Dmdmdx（4周）的免疫熒光染色顯示pCreb（綠色）、Pax7（紅色）和合并。

在觀察到再生骨骼肌中Creb活性升高后，研究人員考察了Creb是否有助于成肌細(xì)胞活化和/或分化。研究結(jié)果表明，壓碎的肌肉提取物（CME）迅速誘導(dǎo)成肌細(xì)胞中的Creb磷酸化，同時CME處理的成肌細(xì)胞中的Creb磷酸化與增加的Creb轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，受損骨骼肌釋放的未知因子會激活受損肌肉內(nèi)成肌細(xì)胞中的 Creb。
 

圖7 Creb由原代成肌細(xì)胞中壓碎的肌肉提取物激活[5]
 

此外，研究人員還評估了Creb-YF功能獲得突變對成肌細(xì)胞增殖和分化的影響，這兩個過程是肌肉再生的一部分。研究結(jié)果表明，活化的Creb促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化，而激活的Creb驅(qū)動成肌細(xì)胞增殖和肌發(fā)生分化的早期步驟，可能分別通過直接調(diào)控驅(qū)動細(xì)胞周期和肌發(fā)生的基因。
 

圖8 活化的Creb促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化[5]
 

A Creb+/+和CrebYF/YF成肌細(xì)胞在5天內(nèi)的生長曲線測定；B 異步成肌細(xì)胞培養(yǎng)中BrdU陽性核的百分比；C 異步成肌細(xì)胞中的CyclinA和HSP90蛋白；D Myf5和GAPDH控制Creb+/+和CrebYF/YF肌細(xì)胞的分化；E 在分化培養(yǎng)基中，Creb+/+和CrebYF/YF肌細(xì)胞中的肌肉特異性蛋白（DM）；F 2天分化的Creb+/+和CrebYF/YF肌管的相襯圖像。

以上結(jié)果表明，Creb磷酸化和靶基因響應(yīng)骨骼肌損傷而被激活，并且激活的Creb驅(qū)動成肌細(xì)胞增殖。此外，Creb的基因激活促進(jìn)了肌肉萎縮癥小鼠急性肌肉損傷和再生后的增殖。

總結(jié)
CREB蛋白是真核生物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一個重要的核轉(zhuǎn)錄因子，通常作為核內(nèi)信號通路的交匯與終止點，調(diào)控著上下游信號分子，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)，不可缺少。此外，Creb是肌肉分化和存活的多個階段的重要調(diào)控因子。Creb1基因編輯小鼠可研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與機體生長發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、防御反應(yīng)等功能相關(guān)的疾病，如在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤方面等都有涉及。
 

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建

賽業(yè)生物構(gòu)建了Creb1基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠，更有活體小鼠已加入『紅鼠資源庫』，快至2周交付！確保您在短時間內(nèi)獲得更具性價比的實驗用鼠，為您的研究加點速。

 

Creb1基因敲除小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~
 

品系名稱：
C57BL/6J-Creb1em1Cya

品系編號：
KOCMP-12912-Creb1-B6J-VA

產(chǎn)品編號：
S-KO-01615

應(yīng)用方向：
肌肉、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)

打靶方案：

Creb1基因敲除小鼠打靶方案示意圖
 

Creb1條件性 基因敲除小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：
C57BL/6J-Creb1em1(flox)Cya

品系編號：
CKOCMP-12912-Creb1-B6J-VA

產(chǎn)品編號：
S-CKO-01857

應(yīng)用方向：
肌肉、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)

打靶方案：

Creb1條件性基因敲除小鼠打靶方案示意圖

紅鼠資源庫
賽業(yè)“紅鼠資源庫”可以為您提供包括Creb1在內(nèi)的多系列的完全性敲除小鼠和條件性敲除小鼠模型。強大的數(shù)據(jù)庫給您更便捷的體驗，研究人員能夠在線查詢、設(shè)計和優(yōu)化基因編輯方案并比較研究數(shù)據(jù)和成果，并咨詢訂購。

如有需要，歡迎撥打400-680-8038或掃碼聯(lián)系我們咨詢訂購~

參考文獻(xiàn)：

[1] Shaywitz A J ,  Greenberg M E . CREB: A Stimulus-Induced Transcription Factor Activated by A Diverse Array of Extracellular Signals[J]. Annual Review of Biochemistry, 1999, 68(1):821-861.

[2] Mantamadiotis T ,  Lemberger T ,  Bleckmann S C , et al. Disruption of CREB function in brain leads to neurodegeneration[J]. Nature Genetics, 2002, 31(1):47-54.

[3] Chen A E ,  Ginty D D ,  Fan C M . Protein kinase A signalling via CREB controls myogenesis induced by Wnt proteins.[J]. Nature, 2005, 433(7023):317-322.

[4] Keren A ,  Keren-Politansky A ,  Bengal E . A p38 MAPK-CREB pathway functions to pattern mesoderm in Xenopus.[J]. Developmental Biology, 2008, 322(1):86-94.

[5] Stewart R ,  Flechner L ,  Montminy M , et al. CREB Is Activated by Muscle Injury and Promotes Muscle Regeneration[J]. Plos One, 2011, 6(9):e24714.