PTPN22-/-小鼠助力發(fā)現(xiàn)血小板功能和動(dòng)脈血栓調(diào)控的新機(jī)制

蛋白磷酸化和去磷酸化在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件中發(fā)揮著重要作用，此過程主要由蛋白酪氨酸激酶（PTK）和酪氨酸去磷酸酶（PTP）所調(diào)控^[1]。在血小板受刺激時(shí)，PTK發(fā)生磷酸化進(jìn)而啟動(dòng)血小板活化信號(hào)，而PTP使磷酸化蛋白去磷酸化以下調(diào)血小板功能，阻止其進(jìn)一步活化^[2,3]。PTPN22（protein tyrosine phospha- tase，nonreceptor type 22）在造血細(xì)胞中表達(dá)，是一種負(fù)調(diào)控T細(xì)胞信號(hào)的蛋白酪氨酸磷酸酶，通過去磷酸化T細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶來抑制T細(xì)胞抗原受體（TCR）信號(hào)。

2022年9月，徐州醫(yī)科大學(xué)血液病研究所喬建林團(tuán)隊(duì)在血液學(xué)領(lǐng)域頂級(jí)期刊Blood發(fā)表題為“Protein tyrosine phosphatase PTPN22 negatively modulates platelet function and thrombus formation”的研究論文，研究了PTPN22在血小板中的表達(dá)及其作用，揭示了血小板功能和動(dòng)脈血栓調(diào)控的新機(jī)制。研究生王霞敏、魏光玉和丁洋洋是論文的共同第一作者，喬建林教授、徐開林教授和曾令宇教授為共同通訊作者。
 

研究材料
PTPN22^-/-小鼠（由賽業(yè)生物提供）、野生型小鼠

技術(shù)方法
流式細(xì)胞術(shù)、動(dòng)脈血栓模型，深靜脈血栓模型、出血模型、蛋白印跡、免疫共沉淀、定量磷酸化蛋白組學(xué)、蛋白體外表達(dá)及純化、體外去磷酸化檢測(cè)等。

技術(shù)路線
01PTPN22^-/-和WT小鼠

02體內(nèi)出血和血栓形成模型

03體外血小板功能檢測(cè)分析

04磷酸化蛋白組學(xué)探索PTPN22潛在底物

05體外分析驗(yàn)證組學(xué)的結(jié)果

研究結(jié)果
1.血小板表達(dá)PTPN22，且其缺失促進(jìn)血小板參與體內(nèi)止血和血栓形成
研究者首先在人和小鼠血小板及巨核細(xì)胞均檢測(cè)到了PTPN22（圖1）。利用PTPN22基因敲除小鼠（該小鼠由賽業(yè)生物提供），發(fā)現(xiàn)PTPN22敲除顯著增強(qiáng)血小板參與體內(nèi)止血和動(dòng)脈血栓形成。體外flow chamber實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證PTPN22敲除血小板的粘附和體外血栓形成顯著增強(qiáng)。
 

 

2.PTPN22敲除顯著增強(qiáng)血小板聚集、顆粒釋放、aIIbb3活化和鈣動(dòng)員
為探索PTPN22對(duì)體外血小板功能的影響，研究者分離血小板，使用不用激活劑來刺激血小板，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTPN22缺失顯著促進(jìn)體外血小板聚集，顆粒釋放、aIIbb3活化及鈣離子動(dòng)員（圖2）。

 

3.PTPN22缺失顯著促進(jìn)血小板鋪展和血塊收縮
為分析PTPN22對(duì)整合素aIIbb3“由外向內(nèi)”信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，研究者進(jìn)行了血小板鋪展和血塊收縮實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PTPN22敲除的血小板在膠原或纖維蛋白原上的鋪展能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)凝血酶誘導(dǎo)的血塊收縮也顯著加快（圖3）。
 

4.PTPN22敲除影響血小板活化后眾多蛋白的磷酸化
為探索PTPN22參與調(diào)控血小板功能的分子機(jī)制，研究者進(jìn)行了定量磷酸化蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PTPN22敲除引起血小板內(nèi)眾多蛋白磷酸化水平的差異（圖4）。通過比較WT和PTPN22敲除血小板活化后的磷酸化肽段，發(fā)現(xiàn)9個(gè)上調(diào)的磷酸化肽段和18個(gè)下調(diào)的。由于PTPN22敲除引起血小板活性增加，為此研究者重點(diǎn)關(guān)注了9個(gè)上調(diào)的磷酸化肽段。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)磷酸化肽段中只有PDE5A的磷酸化與血小板功能相關(guān)，為此，接下來實(shí)驗(yàn)選擇PDE5A作為研究對(duì)象。
 

5.PTPN22敲除上調(diào)PDE5A磷酸化
為驗(yàn)證磷酸化蛋白組學(xué)結(jié)果，研究者檢測(cè)了體外血小板經(jīng)刺激后PDE5A的磷酸化，發(fā)現(xiàn)PTPN22敲除血小板內(nèi)PDE5A磷酸化顯著高于WT血小板。此外，PTPN22敲除后顯著降低了負(fù)向調(diào)控血小板功能的cGMP水平和VASP的磷酸化（圖5）。此外，研究者發(fā)現(xiàn)使用PDE5A抑制劑可逆轉(zhuǎn)PTPN22敲除后引起的血小板高反應(yīng)性。
 

6.PTPN22與磷酸化PDE5A結(jié)合并使其去磷酸化
為進(jìn)一步探索PTPN22與PDE5A的關(guān)系，研究者進(jìn)行了CO-IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)血小板活化后PTPN22與磷酸化PDE5A結(jié)合（圖6），通過體外表達(dá)純化PTPN22活性片段和使用磷酸化肽段，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)PTPN22可使磷酸化的PDE5A的Ser去磷酸化，且其去磷酸化活性顯著高于Tyr去磷酸化。

7.抑制人PTPN22可顯著增強(qiáng)人血小板功能
為驗(yàn)證PTPN22是否在人血小板發(fā)揮相同作用，研究者使用了PTPN22抑制劑LTV-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制人血小板PTPN22顯著增強(qiáng)血小板聚集能力、鋪展和血塊收縮及上調(diào)PDE5A磷酸化（圖7），與小鼠結(jié)果一致。
 

圖7 PTPN22在人血小板功能中的作用
 

研究結(jié)論
在本項(xiàng)研究中，通過利用PTPN22基因敲除小鼠，研究者系統(tǒng)性分析了PTPN22在血小板功能和血栓形成中的作用及其分子機(jī)制。首次證明了PTPN22在血小板功能和動(dòng)脈血栓形成中的新作用，確定了未來預(yù)防血栓或心血管疾病的新潛在靶點(diǎn)。

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建
賽業(yè)生物構(gòu)建了Ptpn22基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠，更有活體小鼠已加入『紅鼠資源庫』，快至2周交付！確保您在短時(shí)間內(nèi)獲得更具性價(jià)比的實(shí)驗(yàn)用鼠，為您的研究加點(diǎn)速~

 

Ptpn22基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Ptpn22^em1Cya
品系編號(hào)：
KOCMP-71198-Otud1-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-KO-03910
應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué)、免疫系統(tǒng)/心血管系統(tǒng)、水解酶
打靶方案：

Ptpn22條件性基因敲除小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：
C57BL/6J-Ptpn22^em1(flox)Cya
品系編號(hào)：
CKOCMP-19260-Ptpn22-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-04585
應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué)、免疫系統(tǒng)/心血管系統(tǒng)、水解酶
打靶方案：

參考文獻(xiàn)：

1. Xu Y, Fisher GJ. Receptor type protein tyrosine phosphatases (RPTPs)— roles in signal transduction and human disease. J Cell Commun Signal. 2012;6(3):125-138.

2. Senis YA. Protein-tyrosine phosphatases: a new frontier in platelet signal transduction. J Thromb Haemost. 2013;11(10):1800-1813. 

3. Faria AVS, Andrade SS, Peppelenbosch MP, Ferreira-Halder CV, Fuhler GM. The role of phospho-tyrosine signaling in platelet biology and hemostasis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2021;1868(3):118927.

4. Wang X, Wei G, Ding Y, et al. Protein tyrosine phosphatase PTPN22 negatively modulates platelet function and thrombus formation. Blood. 2022;140(9):1038-1051.
 

原文檢索：

Xiaofei Zhang, Tingting Cong, Lei Wei, et al. YTHDF3 modulates hematopoietic stem cells by recognizing RNA m6A modification on Ccnd1. Haematologica Early view Feb 3, 2022