RNA-seq助力揭示實體腫瘤潛在新療法

靶向GPC3的CAR-T細胞對有細胞因子釋放綜合征（CRS）風險的肝細胞癌患者的治療初顯成效。幾種采用天然TCR信號傳導的T細胞過繼療法（ACT）在實體腫瘤中誘導了更有效的抗腫瘤功能，并減少了相對于CAR的細胞因子產生。

該研究構建的sFv-ε T細胞在減少細胞因子釋放的同時顯示出良好的抗腫瘤效果。RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)這可能與鈣-鈣調磷酸酶-NFAT信號通路活性較低有關。此外，研究進一步構建GPC3特異性7sFv-ε T細胞，并在臨床前小鼠模型中評估了其抗腫瘤活性，揭示了GPC3特異性7sFv-ε T細胞在實體腫瘤治療中的潛力。

文章詳情

發(fā)表時間：2022-04-19

發(fā)表期刊：Molecular Therapy – Oncolytics（IF=7.2）

關鍵詞：GPC3；嵌合sFv-CD3ε受體；IL-7；免疫療法；實體腫瘤；RNA-seq

研究對象：小鼠

研究方法：RNA-seq、流式細胞術、免疫組化等

DOI：10.1016/j.omto.2022.04.003.

 

研究背景

靶向GPC3的CAR-T細胞對有細胞因子釋放綜合征（CRS）風險的肝細胞癌患者的治療初顯成效。幾種采用天然TCR信號傳導的T細胞過繼療法（ACT）在實體腫瘤中誘導了更有效的抗腫瘤功能，并減少了相對于CAR的細胞因子產生。為了提高靶向GPC3的ACT的有效性和安全性，研究用與CD3ε連接的抗GPC3單鏈可變區(qū)片段（sFv）修飾T細胞，將其整合到整個TCR/CD3復合物中，形成嵌合sFv-CD3ε受體（sFv-ε）。發(fā)現(xiàn)sFv-ε T細胞在減少細胞因子產生的同時顯示出良好的抗腫瘤活性，RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)這可能與鈣-鈣調磷酸酶-NFAT信號通路活性較低有關。研究進一步構建了IL-7共表達的小鼠sFv-ε T細胞（7sFv-ε），發(fā)現(xiàn)在具有免疫功能的小鼠模型中，與傳統(tǒng)的sFv-ε T細胞相比，7sFv-ε T細胞表現(xiàn)出更強的持久性、抗腫瘤療效和免疫記憶性，同時，保留了與CRS相關的低細胞因子的產生。這些結果表明，GPC3特異性7sFv-ε T細胞可能是一種潛在實體腫瘤治療策略。

 

研究思路

 

研究結果

1. 與CAR-T細胞相比，人sFv-ε T細胞具有自激活減輕的TCR樣信號傳導

為了探究sFv-ε是否可以介導TCR樣信號，用原代人T細胞制備的抗GPC3 sFv-ε T或CAR-T細胞。未轉導（UTD）T細胞做為對照，評估被GPC3肽激活時sFv-ε T或CAR-T細胞中關鍵TCR信號分子的磷酸化動力學和持續(xù)時間。接下來，研究者進一步分析了抗原非依賴性信號傳導（tonic signaling）是否會促進T細胞分化和衰竭。結果表明，在抗原刺激下，sFv-ε可以誘導內源性CD3ζ的磷酸化，暗示sFv-ε可以通過整個TCR/CD3復合體轉導抗原激活。此外，與CARs相比，sFv-ε顯著減弱了抗原非依賴性信號（圖1）。

圖1 在人28ζ CAR、BBζ CAR和sFv-ε T細胞中激活、分化和抑制表型的不同特征

 

2、人sFv-ε T細胞在減少細胞因子產生的同時顯示出良好的抗腫瘤效果

與CAR-T細胞治療相關的CRS的特點是外周細胞因子升高，包括IL6、IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF。通過體外細胞因子釋放實驗發(fā)現(xiàn)，sFv-ε T細胞通常比CAR-T細胞誘導的IL6、IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF的分泌更少（圖2B）。評估sFv-ε和CAR-T細胞在PLC/PRF/5荷瘤小鼠體內的抗腫瘤療效（圖2C）發(fā)現(xiàn)，在注射T細胞7天后與28ζ和BBζ CAR-T組相比，sFv-ε T組外周血中CD4+和CD8+T細胞的持久性增強（圖2D）。sFv-ε T細胞在早期誘導腫瘤消退的程度優(yōu)于CAR-T細胞（圖2E）。在實驗結束時，sFv-ε T細胞或BBζ CAR-T細胞比28ζ CAR-T細胞更有效地抑制腫瘤生長（圖2F）。在另一項實驗中，研究人員檢測了接受了大量T細胞的荷瘤小鼠體內的細胞因子。與CAR-T細胞治療的小鼠相比，sFv-ε T細胞治療的小鼠外周血和腫瘤組織中存在人IFNγ、TNFα、IL2和小鼠IL6減少的趨勢（圖2G）。這些數(shù)據(jù)表明，人GPC3特異性sFv-ε T細胞在減少一些與CRS相關細胞因子產生的同時顯示出與CAR-T細胞相比具有競爭力的抗腫瘤效果。

圖2 人28ζ CAR、BBζ CAR和sFv-ε T細胞的抗腫瘤活性和細胞因子產生的特征

 

3、與CAR相比，sFv-ε介導的鈣-鈣調磷酸酶-NFAT信號活性較低

為探究sFv-ε或CAR信號通路對細胞因子轉錄的調節(jié)是否不同，對受高水平GPC3肽刺激的T細胞進行RNA-seq。如圖3C所示，與28ζ或BBζ CAR-T細胞相比，sFv-ε T細胞中許多NFAT調節(jié)的細胞因子的mRNA表達水平降低，包括IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF。鈣/鈣調磷酸酶/NFAT網(wǎng)絡在細胞因子的產生中起著重要作用。細胞內Ca2+的增加導致鈣調磷酸酶的快速激活，導致NFAT去磷酸化、核易位和隨之而來的基因轉錄。此外，鈣調磷酸酶抑制劑FK506幾乎完全消除了所有工程T細胞產生IFNγ、TNFα和IL2，表明這些細胞因子主要受鈣調磷酸酶-NFAT通路調控（圖3B）�；�因集富集分析（GSEA）顯示，鈣離子轉運在sFv-ε T細胞中的正調控活性低于CAR-T細胞（圖3D）。因此，研究進一步分析了人sFv-ε細胞和CAR-T細胞與PLC/PRF/5細胞共培養(yǎng)后細胞內Ca2+水平。sFv-ε T細胞中Ca2+的增加幅度和持續(xù)時間均低于CAR-T細胞（圖3E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，sFv-ε T細胞中鈣-鈣調磷酸酶-NFAT通路的活性低于CAR-T細胞，這可能有助于減少IFNγ、TNFα和IL2的產生。

圖3 sFv-ε或CAR介導的鈣-鈣調磷酸酶-NFAT信號通路的特征

 

4、IL7共表達可提高小鼠7sFv-ε T細胞的體外存活率

為了提高T細胞的存活率和免疫記憶，通過將sFv-ε和IL7與一個2A肽序列融合，構建了小鼠sFv-ε，共表達IL7（圖4A）。用各自的逆轉錄病毒轉導C57BL/6小鼠的脾T細胞，生成sFv-ε、7sFv-ε或CAR T細胞。分析小鼠T細胞的記憶分化和衰竭表型發(fā)現(xiàn)sFv-ε和7sFv-εT細胞的CD44+CD62L+中樞記憶性T細胞比例高于28ζ和BBζ CAR T細胞（圖4C和圖4D），與CAR T細胞相比，sFv-ε和7sFv-εT細胞的PD-1和LAG-3表達顯著降低（圖4E和圖4F）。為了評估T細胞對IL2缺乏誘導凋亡的易感性，在沒有加入IL2的情況下，T細胞孵育24小時。與預期相符，7sFv-εT細胞的凋亡率顯著低于其他工程T細胞（圖4G和圖4H）。利用Western blot分析細胞凋亡相關蛋白的表達，結果表明，與其他工程T細胞相比，7sFv-ε T細胞降低了caspase 3的活化，同時上調表達了抗凋亡的Mcl-1、Bcl-xL和Survivin（圖4I）。此外，在低濃度IL2的體外培養(yǎng)條件下，7sFv-ε T細胞比傳統(tǒng)的sFv-ε T細胞具有更強的增殖能力。

圖4 IL7對小鼠7sFv-ε T細胞的體外作用

 

5、7sFv-εT細胞顯示出良好的體內抗腫瘤效果

小鼠工程T細胞的體內抗腫瘤活性首次在Hepa 1-6-GPC3模型中評估，該模型具有免疫應答特性（圖5C）。傳統(tǒng)的sfv-ε和28Z CAR T細胞抑制腫瘤生長和延長小鼠存活時間，而BBζ CAR T細胞在6只小鼠中的3只里更早失去抑制腫瘤生長的能力。與其他工程T細胞相比，7sFv-εT細胞在治療40天后在6只小鼠中的4只里完全根除了腫瘤，并顯著提高了小鼠的存活率（圖5D和圖5E）。而進一步用原位E0771-GPC3模型評估發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的SFV-εT細胞和CAR T細胞無法控制腫瘤的進展，然而7sFv-εT細胞仍表現(xiàn)出比其他細胞更快的抗腫瘤作用，并最終幾乎完全消除腫瘤（圖5G和圖5H）。在Hepa 1-6-GPC3模型中檢測細胞因子的釋放，發(fā)現(xiàn)在外周血中，sFv-ε和7sFv-εT細胞比BBζ CAR T細胞產生或誘導更低水平的IFNγ、TNFα 和 IL6。而在腫瘤組織里，與CAR T細胞相比，上述兩種細胞具有產生更少IFNγ和TNFα的趨勢（圖5I）。結果表明，sFv-ε和7sFv-ε T細胞與CAR-T細胞相比，可能降低免疫活性宿主的CRS風險。

圖5 小鼠28ζ CAR、BBζ CAR、sFv-ε和7sFv-ε T細胞的抗腫瘤活性和細胞因子產生的特性

 

6.IL7的共表達提高了小鼠7sFv-εT細胞的持久性，并在體內誘導了免疫記憶

為了闡明7sFv-ε T細胞抗腫瘤能力增強的機制，研究了T細胞在Hepa 1-6-GPC3模型中的持久性。如圖6A和6B所示，7sFv-ε和28ζ CAR-T組比sFv-ε和BBζ CAR-T組有更多的CD4+ T細胞。7sFv-ε T細胞增加了CD8+ T細胞和9F2+ T細胞的積累，其次是sFv-ε，28ζ CAR-T和BBζ CAR-T細胞。7sFv-ε T細胞組的轉導基因拷貝數(shù)顯著高于其他T細胞工程組（圖6C）。此外，7sFv-ε T細胞組的腫瘤浸潤CD8+細胞顆粒酶B表達升高，表明其抗腫瘤的細胞溶解能力增強（圖6D）。7sFv-ε T細胞處理的小鼠脾臟中9F2+ T細胞存活率最高（圖6E）。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，7sFv-ε T細胞抗腫瘤能力的提高應該至少部分歸因于輸入的T細胞的持久性增加。在用7sFv-ε T細胞去除原發(fā)腫瘤后，在小鼠的兩側脅腹重新注射Hepa 1-6-GPC3細胞（圖6J）。7sFv-ε T細胞處理組小鼠與對照組比較表明，在持續(xù)4周以上的全部6只小鼠中，腫瘤均立即消除，這表明7sFv-ε T細胞治療可以提供長期保護，防止腫瘤復發(fā)（圖6K）。

圖6 7sFv-ε T細胞治療提高了T細胞的持久性和免疫記憶

 

研究結論

sFv-ε可以顯著降低相對于CARs的T細胞自激活，并介導抗原特異性TCR樣信號。與28ζ和BBζ CAR-T細胞相比，人類和小鼠的傳統(tǒng)sFv-ε T細胞在減少細胞因子產生的同時表現(xiàn)出相同或更強的抗腫瘤療效。GPC3特異性7sFv-ε T細胞進一步提高了抗腫瘤免疫功能，同時保留了CRS相關細胞因子的低產量，提示它可能是一種有效、安全的實體腫瘤治療策略。參考文獻：

Yansha Sun, Yiwei Dong, Ruixin Sun, Yifan Liu, Yi Wang, Hong Luo, Bizhi Shi, Hua Jiang, Zonghai Li,Chimeric anti-GPC3 sFv-CD3ε receptor-modified T cells with IL7 co-expression for the treatment of solid tumors,Molecular Therapy - Oncolytics,Volume 25,2022,Pages 160-173,ISSN 2372-7705,https://doi.org/10.1016/j.omto.2022.04.003.