免疫組化技術專題之抗原修復的方法與步驟介紹

眾所周知，甲醛雖然作為免疫組化常用固定劑，但甲醛也會使組織細胞許多抗原的免疫活性丟失，從而導致免疫組化染色失敗。采用特殊手段恢復組織細胞的免疫活性的方法就是抗原修復�？乖�修復是免疫組化染色中的關鍵環(huán)節(jié)，也是較為復雜繁瑣的一步。

一、抗原修復的方法
FFPE（甲醛固定、石蠟切片）在水溶性介質中加熱，在組織切片脫蠟和水化后，玻片浸沒于修復液^①中。加熱時間和溫度直接影響修復效果。

常用的加熱方法：微波爐、高壓滅菌器、蒸汽鍋、壓力鍋和水浴箱。溫度接近100℃，加熱時間一般20分鐘就可獲得較滿意的結果，加熱后放置20~30分鐘緩慢冷卻。接下來介紹常用的高壓抗原修復法。

高壓抗原修復操作步驟：

1. 切片常規(guī)脫蠟至水；

2. 蒸餾水洗：3次/2min；

3. 石蠟切片放置于高壓鍋內：8~10min；

4. 再次進行蒸餾水洗；

5. PBS液洗2分鐘3次；

6. 接連免疫組化染色。

注意事項：將1500~3000ml的抗原修復液注入高壓鍋中加熱至沸騰，石蠟切片置于切片架上，放入鍋內，沒過液面以下，大概加熱5-6min，當高壓鍋開始緩慢噴氣時計時2-3min，然后將高壓鍋冷卻至室溫取出石蠟切片后按上述步驟進行。如果采用隔水式修復法，請適當將修復時間延長至10分鐘以上。

二、抗原修復操作繁復怎么辦？
免疫組化常用切片主要包括石蠟切片和冰凍切片兩種，根據樣本類型、抗體類型、切片要求等條件的不同，對應免疫組化要求也不同。同時石蠟切片在免疫組化實驗中制片步驟繁瑣，組織前處理要求高，可能破壞抗原，需要做抗原修復；而冰凍切片能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。

想要避開抗原修復這一步驟，免疫組化切片時可以選擇冰凍切片。冰凍切片雖然無需抗原修復，但在免疫組化時細胞內易形成冰晶而破壞細胞結構，并且切片厚度也較石蠟的厚，會直接影響切片質量。想要獲得高質量冰凍切片，選擇一臺高質量的冷凍切片機是關鍵。

三、瑞沃德冷凍切片機用于免疫組化實驗冷凍切片的優(yōu)勢 

• 緩解片子偏厚問題

1. 壓縮機冷量輸出大可做二次溫控補償；PID控溫，使得箱體溫度在一定范圍內波動且可以自動恢復；

2. 頂/級十字交叉導軌搭配五相高分辨率步進電機、精密絲桿和水平進樣滑塊，組成高精準進樣系統(tǒng)；

3. 以上兩點保證切片無需設置過厚就能切出滿足需求的片子。

• 緩解冰晶產生的壓力

冰晶主要產生于樣本冷凍包埋階段，因為冷凍過程緩慢從而產生冰晶，這就要求設備的冷凍效果要滿足樣本速凍需求。瑞沃德冷凍切片機速凍臺最低溫度可達-42℃，快速制冷點溫度最低可達-60℃，滿足速凍需求，同時箱體和樣本頭均可單獨制冷，從而減少冰晶產生，保證切片質量。

注釋①：建議修復液的PH僅2、6、8或10。0.01mol/LpH1或10的Tris-HCI修復液染色效果較好。

參考文獻：病理技術大講堂1001問-病理技術操作疑難點解惑答疑. 席越，陳軍主編.人民衛(wèi)生出版社