熒光定量PCR對照詳解

前言

吾日三省吾身，定量實驗做對照了嗎？

在熒光定量PCR實驗中遇到?jīng)]有曲線、曲線異常等情況，我們總是會在第一時間去看陽性對照和陰性對照的擴增情況來分析原因。由此可見，實驗中做對照的重要性不言而喻。

在熒光定量PCR實驗中，我們通常會按照如下的流程進行實驗：樣品采集，運輸，樣品處理，核酸提取，反轉錄（RNA 病毒），擴增 ，結果讀取。為了提高實驗結果的精準度，我們通常會通過設置對照的方式對檢測的各個環(huán)節(jié)進行監(jiān)控。

陰性對照

熒光定量PCR的靈敏度較高，對實驗室的污染也非常敏感，陰性對照可以用來監(jiān)控和發(fā)現(xiàn)污染的發(fā)生。常用的陰性對照包括以下幾種：

無模板對照（No Template Control, NTC）

使用水代替熒光定量 PCR反應中的核酸，其它試劑按比例正常加入，用于監(jiān)控擴增反應體系中的污染。正常情況下，NTC孔不會有擴增；當NTC出現(xiàn)擴增，則預示體系中有污染。在SYBR Green實驗中，引物二聚體的形成也可能導致NTC出現(xiàn)擴增。

陰性樣本對照（Negative Sample Control）

陰性樣本對照指不含有目的基因或者靶序列的樣本，也可以是樣本保存液。和含有目的基因的樣本一起進行核酸提取等過程。如果出現(xiàn)擴增，則說明實驗過程中存在污染，結合NTC結果進行判斷。

無逆轉錄酶對照（No Reverse-Transcriptase Control, No RT）

當進行RNA定量實驗時，如果引物和探針設計在同一個外顯子上，擴增有可能來源于未去除干凈的DNA，此時可以設置無逆轉錄酶對照。無逆轉錄酶對照中不加逆轉錄酶。由于沒有cDNA，DNA聚合酶無法擴增mRNA，則不應發(fā)生擴增。如果檢測到擴增，則樣本中可能含有未去除干凈的DNA。

陽性對照

陽性對照必然是陽性的結果，用于排除假陰性。如果檢測出來了這個樣本不是陽性，則說明實驗有問題，不可靠。

陽性樣本對照（Positive Sample Control）

陽性內對照雖然可以在一定程度上反應核酸提取效率，但是卻很難反饋提取流程中對核酸釋放的效率。為了能更好的反映提取效率，可以選擇已知陽性的樣本或者保存在相似基質中已知濃度的病原體，作為單獨的樣本進行提取和后續(xù)的RT-PCR，通過Ct值評斷實驗流程。

內參基因（Endogenous Control）

內參基因可以用于反應樣本本身的質量，比如拭子是否刮取到樣本、RNA在運輸和保存過程中是否有嚴重的降解等問題。內參基因一般選擇在取樣組織或細胞中均有足量表達的基因，且其表達量不受環(huán)境、實驗處理條件和取樣時間等因素影響，常用內參基因如表1所示。沒有某個內參基因是萬能的，內參基因需要根據(jù)樣本類型和實驗處理方式進行評估和選擇。實驗中通過內參基因的Ct值來判斷取樣和樣本降解情況。在相對定量實驗中，內參基因亦可用于對取樣量進行均一化。

▲ 表1: 已報道的部分物種qPCR內參基因

擴增對照（Amplification Control）

可使用含有擴增片段的質粒、假病毒或者基因組DNA/cDNA作為擴增陽性對照，監(jiān)控熒光定量PCR的體系是否正常。當擴增對照沒有擴增，或者Ct值大于預期，則說明定量PCR體系存在問題。

內部陽性對照（Internal Positive Control, IPC）

如果想監(jiān)控每一份樣本的整個實驗過程，可以在提取之前在每個樣本中加入一段外源DNA或RNA（不含目的片段），并在定量PCR時進行單管多重PCR，同時檢測目的基因和這段序列。在每個樣本中加入特定拷貝數(shù)的IPC，進而從該段序列的Ct值判斷對應樣品孔中的核酸富集和擴增效率。