UL-1000超微量可見分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量檢測(cè)方案

核糖核酸(縮寫為RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成長(zhǎng)鏈狀分子。一個(gè)核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種，即A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。
原理細(xì)胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白，DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程。

儀器及試劑
UL-1000超微量可見分光光度計(jì)
離心管 離心機(jī)  電泳槽 凝膠板
細(xì)胞樣品
RNA提取試劑盒 熒光定量PCR Mix TRIZOL dNTP 氯仿 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 異丙醇 Taq酶 DEPC水 ddH2O TE MgCl2 瓊脂糖 溴化乙錠 MOPS 甲醛 乙酸鈉 EDTA EB 溴酚蘭

樣品RNA的抽提
 1.  取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
 2.  兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
 3.  RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
 4.  RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀�；靹蚝�，4℃下7000 rpm離心5分鐘。
 5.  RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
 6.  溶解RNA沉淀溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40ul用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

RNA質(zhì)量檢測(cè)
1.紫外吸收法測(cè)定
 先用稀釋用的TE溶液將紫外分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液濃度和純度。
 （1）濃度測(cè)定
 A260下讀值為1表示40ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 ug/ml。具體計(jì)算如下：
 RNA溶于40ul DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495ul的TE中，測(cè)得A260 = 0.21
 RNA濃度= 0.21 x 100 x 40ug/ml = 840ug/ml或0.84ug/ul
 取5ul用來測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35ul，剩余RNA總量為：
 35ul x 0.84ug/ul= 29.4ug
 （2）純度檢測(cè)
 RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

 2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
 （1）制膠
 1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。
10x MOPS電泳緩沖液
濃度     成分
0.4 M  MOPS，pH 7.0
0.1 M  乙酸鈉
0.01 M  EDTA
 灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。
 （2）準(zhǔn)備RNA樣品
 取3ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
 （3）電泳
 上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。
 （4）紫外透射光下觀察并拍照
 28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。

 結(jié)果計(jì)算
RNA得率有很強(qiáng)的組織特異性，不同組織RNA的豐度和RNA提取的易難程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說，可通過分光光度計(jì)測(cè)定RNA溶液在260nm處的吸光值來計(jì)算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質(zhì)濃度和蛋白等有機(jī)物的吸收值。用標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得在波長(zhǎng)260nm處，1ug/mlRNA鈉吸光度0.025（光程為1cm），即OD260=1時(shí)，樣品中RNA濃度為40ug/ml。通常分光光度計(jì)OD260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的。因此RNA提取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當(dāng)濃度范圍，再用分光光度計(jì)檢測(cè)。按下面的共識(shí)計(jì)算總RNA濃度：
總RNA濃度（ug/ml）=OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml