程序降溫儀在研究對(duì)抗血液系統(tǒng)惡性腫瘤復(fù)發(fā)的CIK細(xì)胞中的應(yīng)用

目前，患有急性白血病或骨髓增生異常等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的患者，在經(jīng)過(guò)同種異體造血干細(xì)胞移植（HSCT）治療后，仍然面臨復(fù)發(fā)的可能，復(fù)發(fā)是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK），在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中均顯示出有效的抗白血病細(xì)胞毒性，因此，CIK細(xì)胞的應(yīng)用，可作為一種有前景的免疫治療方法，用于對(duì)抗復(fù)發(fā)。

考慮到復(fù)發(fā)患者迫切的治療需求，德國(guó)法蘭克福大學(xué)的一支研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出了一種高效的培養(yǎng)工藝，可以利用供體來(lái)源的外周血（PB）或白細(xì)胞去除術(shù)（LP）產(chǎn)品生成不同臨床劑量的即用型CIK細(xì)胞，解決了與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的血清供應(yīng)瓶頸的問(wèn)題，有效地節(jié)省了時(shí)間、人力和成本消耗，且符合良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）。

CIK細(xì)胞的生成

常規(guī)的CIK細(xì)胞培養(yǎng)需要3周的時(shí)間�？紤]到患者治療時(shí)間的緊迫性，研究人員專(zhuān)注于在更短的時(shí)間內(nèi)生成高效的CIK細(xì)胞產(chǎn)品。

通過(guò)在培養(yǎng)的第4和第8天添加IL-15，可以使原始材料中具有CIK細(xì)胞表型的細(xì)胞在10-12天內(nèi)擴(kuò)增。與對(duì)照組相比，IL-15激活的CIK細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)，并且在幾種已建立的人類(lèi)白血病異種移植小鼠模型中具有廣泛的體內(nèi)抗白血病功效，使受體存活率提高。采用此種方法，可以建立一個(gè)高效的、符合GMP規(guī)范的CIK細(xì)胞生產(chǎn)工藝，用于提供不同臨床劑量規(guī)格的細(xì)胞產(chǎn)品：1 × 10^6，5 × 10^6，1 × 10^7，1 × 10^8 T細(xì)胞/kG受體體重，滿(mǎn)足不同患者的需要。

開(kāi)發(fā)替代血清的培養(yǎng)方法
CIK細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)需要添加血清，由于臨床條件下的生產(chǎn)經(jīng)常會(huì)面臨AB血清短缺的瓶頸，研究人員致力于尋找可作為AB血清替代品的培養(yǎng)基補(bǔ)充劑。
通過(guò)分別測(cè)試添加AB血清、新鮮冷凍血漿（FFP）、血小板裂解物（PL）的培養(yǎng)效果，發(fā)現(xiàn)與沒(méi)有補(bǔ)充劑的對(duì)照組相比，AB血清、FFP和PL的存在均可顯著提高細(xì)胞的擴(kuò)增速率（10倍），但在這3這種補(bǔ)充劑之間未觀(guān)察到顯著差異。
進(jìn)一步的檢測(cè)結(jié)果顯示，與AB血清相比，用FFP和PL培養(yǎng)的CIK細(xì)胞顯示出相同的活力、表型（CIK細(xì)胞由CD3+CD56陽(yáng)性的T細(xì)胞、T-NK細(xì)胞和少數(shù)NK細(xì)胞組成）以及針對(duì)白血病靶細(xì)胞系THP-1的細(xì)胞毒性。

注：考慮到FFP更容易獲得，研究人員已決定采用FFP作為CIK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的補(bǔ)充劑，并在此基礎(chǔ)上對(duì)之前的生產(chǎn)許可文件（ATMP § 4b Abs, 3 AMG，許可證號(hào)：PEI.A.11630.01.1）進(jìn)行了相應(yīng)修改。
CIK細(xì)胞的冷凍保存與活力恢復(fù)
按照預(yù)定的給藥劑量，對(duì)生成的CIK細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，可以最大限度地減少細(xì)胞供應(yīng)的時(shí)間和成本。由于此前的報(bào)道缺乏關(guān)于冷凍保存和解凍后CIK細(xì)胞的活力、細(xì)胞毒性等信息。研究人員補(bǔ)充分析了CIK細(xì)胞在經(jīng)過(guò)過(guò)夜凍存和長(zhǎng)期凍存（2年）后的細(xì)胞毒性潛力，結(jié)果令人鼓舞：

經(jīng)冷凍保存的CIK細(xì)胞仍然具有很高的穩(wěn)定性和活力：凍存前的存活率為95.9%，過(guò)夜凍存后的存活率為92.8%，長(zhǎng)期（2年）凍存后的存活率為89.3%。
注：使用可控速率的BIOFREEZE BV45程序降溫儀（Consarctic），可將CIK細(xì)胞穩(wěn)定而安全地保存于冷凍袋中，在液氮中儲(chǔ)存過(guò)夜。

 

注：通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色，對(duì)2016以來(lái)的42個(gè)解凍樣本進(jìn)行分析（此項(xiàng)分析內(nèi)容屬于產(chǎn)品發(fā)布之前QC的一個(gè)重要組成部分），在所有情況下，被測(cè)樣本均滿(mǎn)足>70%存活率的要求。基于這些結(jié)果，CIK細(xì)胞的冷凍保存方法已獲得當(dāng)局（Paul-Ehrlich-Institute）批準(zhǔn)。

同時(shí)，經(jīng)冷凍保存后的CIK細(xì)胞的恢復(fù)能力、表型、細(xì)胞毒性，均與新鮮制備的CIK細(xì)胞無(wú)顯著差異。
技技術(shù)亮點(diǎn)：

CIK細(xì)胞在補(bǔ)充FFP的培養(yǎng)條件下可以保留增殖、活力、表型和功能等主要特征，這些特征在冷凍保存后依然不受影響。研究人員據(jù)此成功建立了符合GMP的CIK細(xì)胞生產(chǎn)工藝，能夠有效減少生產(chǎn)不同治療劑量的CIK細(xì)胞所需的時(shí)間、人力及成本投入。

由于整個(gè)生產(chǎn)工藝對(duì)質(zhì)控有著非常高的要求，最終的細(xì)胞治療效果取決于很多環(huán)節(jié)，其中涉及的與樣本相關(guān)的凍存、溶解以及在液氮中的長(zhǎng)期儲(chǔ)存，對(duì)于后續(xù)細(xì)胞治療的效果尤其重要。對(duì)于凍存，研究人員選擇了Consarctic品牌的BIOFREEZE BV45程序降溫儀，使用液氮制冷，低溫存儲(chǔ)溫度可低至-196℃，提供針對(duì)不同細(xì)胞的冷凍程序，尤其適合于活細(xì)胞樣品的保存。

參考文獻(xiàn)：
Improving Clinical Manufacturing ofIL-15 Activated Cytokine-InducedKiller (CIK) Cells, Front Immunol. 2019 May 31;10:1218. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01218. 

關(guān)于北京博益?zhèn)�業(yè)儀器有限公司

      北京博益Bio-one成立于2004年，一直專(zhuān)注于生物樣本庫(kù)建設(shè)、植物活體分子標(biāo)記成像系統(tǒng)、三維活體小動(dòng)物熒光斷層成像技術(shù)、大分子與細(xì)胞膜表面受體相互作用等領(lǐng)域，致力于為科研用戶(hù)提供更新的技術(shù)與服務(wù)。自2006年，我們開(kāi)始參與農(nóng)業(yè)種子基因庫(kù)與臨床樣本庫(kù)的設(shè)計(jì)與施工，積累了13年的4°C、-20°C、-80°C、液氮溫區(qū)庫(kù)等管理與維護(hù)經(jīng)驗(yàn)；同時(shí)，自2008年開(kāi)始，成像事業(yè)部追蹤最新的活體成像技術(shù)，不斷完善細(xì)胞-組織-活體的成像解決方案。欲了解上述領(lǐng)域內(nèi)更多最新的技術(shù)文獻(xiàn)與資訊，歡迎您關(guān)注此公眾號(hào)或訪(fǎng)問(wèn)本司官網(wǎng) http://www.bio-one.cn。

技術(shù)服務(wù)聯(lián)系方式：
孫元元（技術(shù)部）
Tel：13810818543
柴丹（銷(xiāo)售部）
Tel：13810910943
田建華（應(yīng)用工程師）
Tel：18302907782
張婷瑞（應(yīng)用工程師）
Tel：13910490151
聯(lián)系郵箱：sales@bio-one.cn