3D生物打印技術(shù)在人造和牛之日本科學(xué)家開發(fā)實驗室培育肉中的應(yīng)用

Michiya Matsusaki 教授在大阪大學(xué)的實驗室中展示3D生物打印的“和牛”

如果您曾經(jīng)去過日本并吃過日本著名的和牛（Wagyu），那您肯定知道這種特殊的牛肉會有多貴，這種和牛的價格超過400美元每公斤。不過，不用擔(dān)心，這種情況很快就會發(fā)生改變。因為，在實驗室培育的具有同等口感的和牛已經(jīng)被3D生物打印出來了。

目前，日本科學(xué)家“Michiya Matsusaki”，使用3D生物打印技術(shù)，經(jīng)成功地在實驗室中獲得了以具有大理石紋理脂肪而聞名的和牛（Wagyu）。
 

具有大理石紋理脂肪的和牛（Wagyu）

Michiya Matsusaki教授說：“和牛的脂肪具有大理石紋理的結(jié)構(gòu)。因此，我們希望通過組裝三種類型的細(xì)胞纖維（肌肉，脂肪和血管）來構(gòu)建類似于和牛的大理石紋理結(jié)構(gòu)”。讓我們聽一聽他是怎么做的（視頻1）。
 

Michiya Matsusaki教授還說：“如果我們能用幾種細(xì)胞快速生產(chǎn)大量肉類，我們就有可能在未來更好地應(yīng)對食物和蛋白質(zhì)短缺問題”。Michiya Matsusaki教授還提到，3D生物打印和培養(yǎng)技術(shù)還可以應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)，例如，獲得受損肌肉的替代品。Michiya Matsusaki教授將他的研究成果發(fā)表在自然雜志的子刊《Nature Communications》，在2021年其影響因子：15.861，發(fā)表文章數(shù)量超過7000篇。

那么，Michiya Matsusaki教授是如何制作出和牛的呢？讓我們詳細(xì)了解一下這個過程。文章的題目如下：

文章中介紹到
 

日本神戶牛的“雪花牛肉”（和牛）里含有高達(dá)47.5%的脂肪，脂肪沉積到肌肉纖維之間，形成明顯的紅、白相間，狀似大理石花紋的牛肉，含有大量人體所需的脂肪酸，營養(yǎng)價值比起普通牛肉高不少，而且口感極佳，極具有商業(yè)價值。
 

和牛的組成：
脂肪（Fat）
血管（Blood vessels）
肌肉纖維（Muscle fibers）
方法：HE染色
 

和牛的組成：
毛細(xì)血管（Capillaries）
方法：HE染色

和牛的組成：
膠原纖維（Collagen fibers）
方法：偶氮卡紅染色
 

和牛的組成示意圖
肌肉纖維被基底膜（basement membrane）覆蓋，肌肉束被脂肪和毛細(xì)血管包圍。
※調(diào)整脂肪組織、血管組織、肌肉纖維的比例、數(shù)量和位置是和牛的關(guān)鍵在建制造技術(shù)
如何通過實驗室的方法獲取上述的三種組織（脂肪、血管、肌肉纖維），并將其組裝起來制造出“和牛”，是本文的關(guān)鍵所在。實驗步驟如下：

1 分離、純化細(xì)胞（bSCs、bADSCs）

     bSCs：bovine satellite cells牛衛(wèi)星細(xì)胞 ，用于分化成肌細(xì)胞，生成肌肉纖維
 

bADSCs：bovine adipose-derived stem cells牛脂肪源干細(xì)胞，（1）用于分化成脂肪細(xì)胞，生成脂肪組織。（2）用于分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，生成血管組織。

bSCs分選：文獻(xiàn)中選用不同的流式抗體對細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選出CD31-、CD45-、CD56+、CD29+ 特性的細(xì)胞作為bSCs，可在DMEM中擴(kuò)增（詳細(xì)驗證步驟請參考文獻(xiàn)內(nèi)容）。
 

這一步中可以使用分選儀對細(xì)胞進(jìn)行分選：On-chip sort針對以往傳統(tǒng)流式分選的弊端，推出的一款對細(xì)胞無損傷，確保臨床應(yīng)用的無污染，可以無菌處理操作的流式細(xì)胞儀。 使用微流控芯片模塊，利用空氣壓力控制，對模塊內(nèi)的樣品流進(jìn)行細(xì)胞分離，可配置3激光6熒光。以低壓對細(xì)胞進(jìn)行分選，實現(xiàn)無損傷分離。
 

bADSCs分選：通過消化、過濾、清洗、細(xì)胞傳代等方法獲取bADSCs，可在DMEM中擴(kuò)增（詳細(xì)驗證步驟請參考文獻(xiàn)內(nèi)容）。

2 細(xì)胞分化

（1）分離、提純后的bSCs在傳代增殖的過程中，通過添加胎牛血清（FBS）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、p38抑制劑來保持其分化能力。可以使用2%馬血清（HS）的分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)bSCs分化為肌肉細(xì)胞。驗證后備用。

 

（2）分離、提純、擴(kuò)增后的bADSCs，可以使用ALK5i（TGF-β1抑制劑）誘導(dǎo)其分化為脂肪細(xì)胞，并且按一定配比添加七種游離脂肪酸，促進(jìn)脂肪生成。生成脂肪細(xì)胞，驗證后備用。
 

（3）分離、提純、擴(kuò)增后的bADSCs，可以使用DMEM + 10% HS（馬血清）誘導(dǎo)bADSCs分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，驗證后備用。
 

3 通過3D生物打印機(jī)，打印3種組織纖維，促分化后組裝

（1）打印方法
支持浴輔助3D打�。╯upporting bath-assisted 3D printing），該方法克服了超柔性墨水自身粘度、模量和重力的影響，降低了傳統(tǒng)擠出3D生物打印技術(shù)對于打印結(jié)構(gòu)的限制，有效地維持打印模型的穩(wěn)定性。

（2）支持浴材料選擇
Michiya Matsusaki教授選用明膠和結(jié)冷膠作為支持浴材料，因為它們具有可食用性，可去除性、細(xì)胞相容性。明膠在室溫下是固態(tài)，在37 °C下是液態(tài)。結(jié)冷膠可以在pH 7.4和37℃下，在50mM Tris-HCl緩沖液中溶解。通過混合這兩種膠與水凝膠一起配制支持浴。
 

視頻2：文獻(xiàn)中所用的支持浴輔助3D打印視頻

Bio X系列3D生物打印機(jī)采用多打印頭設(shè)計，可實現(xiàn)多種材料同時打印，結(jié)合最新開發(fā)的DNA studio4軟件，可實現(xiàn)多種打印功能和打印場景。文獻(xiàn)中提到的“支持浴輔助3D打印”，Bio X系列3D生物打印已經(jīng)有相關(guān)應(yīng)用、案例以及文獻(xiàn)，可供參考。
 

Bio X系列用支持浴輔助3D打印技術(shù)，打印的血管結(jié)構(gòu)和具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的條狀模型。
 

（3）細(xì)胞打印用生物墨水
DMEM 、基質(zhì)膠以6:4混合、再添加20mg/mL纖維蛋白原的混合物。（以上材料均可在Cellink購買）

（4）細(xì)胞分化
3D生物打印完成后將組織纖維放置于具有不同粗分化因子的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，并驗證其分化情況。
 

4 和牛組裝
Michiya Matsusaki教授共打印了42根肌肉細(xì)胞纖維、28根脂肪細(xì)胞纖維和2根血細(xì)胞管纖維。為了區(qū)分不同的纖維，使用食用色素將肌肉和血管細(xì)胞纖維染成紅色，使脂肪細(xì)胞纖維染成白色。使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（食物交聯(lián)劑）處理細(xì)胞纖維，按一定比例將它們交聯(lián)在一起，形成類似于和牛的結(jié)構(gòu)。
 

總結(jié)

Michiya Matsusaki教授獲取了bSCs和bADSCs通過支持浴輔助3D打印技術(shù)，打印了這兩種細(xì)胞的纖維，并且促使其分化為肌肉細(xì)胞纖維、脂肪細(xì)胞纖維以及血管細(xì)胞纖維。通過組裝，最終成功的獲得了人工“和牛”。Michiya Matsusaki教授，還提到未來5年內(nèi)，3D生物打印肉的產(chǎn)品即將商業(yè)化。