實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像在多參數(shù)藥理學(xué)篩選中的應(yīng)用
對(duì)人類活動(dòng)的動(dòng)態(tài)記錄促使了抖音等視頻的大流行，同樣的，對(duì)科學(xué)的觀察和記錄也有同樣的追求，正在從靜態(tài)的“快照”觀察轉(zhuǎn)向?qū)铙w動(dòng)態(tài)過程的描述。以實(shí)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)為目的的活細(xì)胞成像正是目前研究動(dòng)物細(xì)胞增殖的理想手段，能幫助生物學(xué)家更好地了解實(shí)驗(yàn)條件可能對(duì)不同系統(tǒng)中細(xì)胞增殖的影響。
本文中，我們將展示使用高通量活細(xì)胞成像平臺(tái)CELLCYTE X™如何方便地獲得多孔板中細(xì)胞的全面、長(zhǎng)時(shí)間、多參數(shù)和實(shí)時(shí)的狀態(tài)，并證實(shí)，CELLCYTE X™基于輪廓增強(qiáng)的細(xì)胞匯合百分比與熒光信號(hào)強(qiáng)度和核或細(xì)胞計(jì)數(shù)指標(biāo)相結(jié)合，可成功用于表征藥物在人和鼠不同細(xì)胞類型中的藥理學(xué)特征。
CELLCYTE X 在藥理學(xué)篩選中的應(yīng)用
實(shí)驗(yàn)背景
細(xì)胞增殖是基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究，尤其是免疫腫瘤學(xué)應(yīng)用藥物發(fā)現(xiàn)中的關(guān)鍵指標(biāo)。細(xì)胞增殖的變化通常通過終點(diǎn)測(cè)定來評(píng)估，例如通過核苷類似物BrdU和EdU的摻入來定量DNA合成，或通過分析增殖報(bào)告蛋白的表達(dá)，例如Ki-67和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）。但在近來20年，活細(xì)胞成像已被證實(shí)是評(píng)估細(xì)胞增殖的一種更加優(yōu)越的技術(shù)，因?yàn)樗蕾囉谠谂囵B(yǎng)箱中數(shù)天或數(shù)周的生長(zhǎng)細(xì)胞圖像的采集和分析，從而提供受控的、一致的環(huán)境條件下細(xì)胞群的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。
在此，我們演示了CELLCYTE X™如何使用多個(gè)參數(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖，詳細(xì)介紹如何通過使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）中的無標(biāo)記融合測(cè)量或通過表達(dá)熒光團(tuán)細(xì)胞的多參數(shù)分析，定量和定性評(píng)估不同藥物的藥理學(xué)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 細(xì)胞增殖的多參數(shù)分析
以CELLCYTE X™增強(qiáng)輪廓（EC）的高對(duì)比度亮場(chǎng)形式和綠色（綠色FL）、紅色（紅色FL）熒光通道對(duì)生長(zhǎng)中的視網(wǎng)膜色素上皮-1（RPE-1）細(xì)胞成像，分別監(jiān)測(cè)核和細(xì)胞質(zhì)熒光團(tuán)的表達(dá)。然后使用CELLCYTE X軟件同時(shí)分析這些圖像，以便以EC匯合百分比、綠色FL細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅色FL細(xì)胞核計(jì)數(shù)的形式推斷細(xì)胞增殖的定量測(cè)量（圖1）。
同時(shí)測(cè)量多個(gè)熒光信號(hào)的能力使CELLCYTE X™成為實(shí)時(shí)分析共培養(yǎng)系統(tǒng)的理想平臺(tái)（圖2）。
通過使用熒光匯流面積百分比衡量指標(biāo)，分析表達(dá)綠色或紅色熒光團(tuán)的乳腺癌細(xì)胞系的增殖情況(圖2B)。每個(gè)視場(chǎng)的熒光物體計(jì)數(shù)表明GFP表達(dá)細(xì)胞具有優(yōu)越的增殖能力（圖2C）。熒光強(qiáng)度(a.u)指標(biāo)更全面地反映了個(gè)體細(xì)胞隨時(shí)間的增殖行為（圖2D和2E）。實(shí)際上，總體紅色熒光強(qiáng)度表明，盡管表達(dá)mCherry的細(xì)胞增殖較低，但熒光信號(hào)強(qiáng)度與GFP信號(hào)相當(dāng)（圖2D）。這可以通過單個(gè)熒光指標(biāo)來解釋，可以從圖2E中所示的隨時(shí)間變化的種群平均水平進(jìn)行分析，也可以從圖2F中所示的所有圖像的單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行分析，證實(shí)了表達(dá)mcherry的細(xì)胞數(shù)量較少，但與表達(dá)GFP的細(xì)胞相比，它們發(fā)出的熒光信號(hào)卻更強(qiáng)烈。
使用CELLCYTE X Studio Software，用戶還可以調(diào)整熒光掩膜靈敏度，只檢測(cè)表達(dá)一定熒光團(tuán)水平的細(xì)胞，這在培養(yǎng)表現(xiàn)不同表達(dá)程度的異質(zhì)細(xì)胞群體時(shí)非常有用。通過利用這些指標(biāo)，可以在高通量設(shè)計(jì)中解釋可變熒光團(tuán)表達(dá)，如應(yīng)用在CRISPR/Cas9 gRNA文庫或facs排序細(xì)胞的基因篩選中。
2. 抑制細(xì)胞增殖藥物的無標(biāo)記劑量反應(yīng)分析
劑量反應(yīng)分析是評(píng)估藥物研發(fā)過程中各種化合物作用的關(guān)鍵工具，特別是在評(píng)估藥物對(duì)不同類型細(xì)胞增殖的影響時(shí)。CELLCYTE X™增強(qiáng)輪廓成像方式是一種高對(duì)比度亮場(chǎng)顯微鏡，可用于獲得精確的無標(biāo)記細(xì)胞匯流測(cè)量。
為了驗(yàn)證細(xì)胞匯合衡量指標(biāo)對(duì)高通量篩選平臺(tái)的適用性，我們監(jiān)測(cè)了在96孔板中用Cycloheximide（一種常用的細(xì)胞毒性蛋白合成抑制劑）和喜樹堿（一種DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑）處理的MEF細(xì)胞的增殖情況。
為了評(píng)估EC匯流衡量指標(biāo)的敏感性和粒度的可譯性，我們獲得這兩種藥物的1:3稀釋劑量-反應(yīng)曲線，覆蓋從0.123 μ M到10 μ M 2-log的濃度范圍。喜樹堿和Cycloheximide治療均獲得了穩(wěn)健的化合物濃度依賴性劑量反應(yīng)（圖3）。喜樹堿處理的MEF，特別是在較低劑量時(shí)，顯示出在應(yīng)用該化合物后的前6小時(shí)內(nèi)匯合度增加。隨后，細(xì)胞毒性作用很快顯現(xiàn)出來。在濃度為0.123µM時(shí)，細(xì)胞匯合穩(wěn)定下降，在濃度為1.11µM至10µM的情況下，匯合呈動(dòng)力學(xué)等效指數(shù)下降（圖3A）。另一方面，經(jīng)Cycloheximide處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更大范圍的細(xì)胞毒性動(dòng)力學(xué)。雖然在前3小時(shí)內(nèi)也觀察到匯合度略有增加，但隨后是一個(gè)較慢且較穩(wěn)定的下降，在濃度峰值時(shí)看到的動(dòng)力學(xué)更快(圖3B)。
這些化合物的不同效力反映在它們的IC50中，該濃度是用48小時(shí)的細(xì)胞匯合數(shù)據(jù)計(jì)算的。MEF細(xì)胞顯然對(duì)喜樹堿（IC50=0.15µM，CI95 0.12–0.17µM）比Cycloheximide（IC50=1.15µM，CI95 1.03–1.48）更敏感（圖3C）。
這一定量數(shù)據(jù)表明Cycloheximide的藥理學(xué)窗口更寬，也反映在定性形態(tài)學(xué)變化中，可以通過CELLCYTE X™生成的高分辨率EC圖像進(jìn)行識(shí)別（圖4）。雖然在1.11 μ M下，兩種藥物在6小時(shí)內(nèi)似乎都不會(huì)影響典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，但在48小時(shí)內(nèi)卻有明顯的差異。使用喜樹堿，可以通過四舍五入的高對(duì)比度細(xì)胞的形式看到廣泛的細(xì)胞死亡。
為了更準(zhǔn)確地反映藥物的細(xì)胞毒性，用于EC合流定量的掩膜被設(shè)置為不識(shí)別大量碎片(圖4，右中)。另一方面，Cycloheximide引起的蛋白質(zhì)合成抑制不僅表現(xiàn)為EC匯合所量化的中度增殖抑制，而且在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為高對(duì)比度核周結(jié)構(gòu)的廣泛積累（圖4，右下角），這些特征可以通過高分辨率EC圖像來識(shí)別。
3. 使用增強(qiáng)型輪廓匯流和熒光通道衡量指標(biāo)的復(fù)合物篩選
前瞻性抗增殖藥物庫的篩選通常通過高通量設(shè)置中的分析來完成，其中單個(gè)指標(biāo)反映了在預(yù)定終點(diǎn)對(duì)細(xì)胞健康的不同測(cè)量。通過使用CELLCYTE X™的增強(qiáng)輪廓和熒光成像模式，可以使用多種指標(biāo)實(shí)時(shí)評(píng)估藥物治療對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
為了驗(yàn)證CELLCYTE X™在合理準(zhǔn)確量化細(xì)胞增殖方面的能力，我們用廣泛濃度的細(xì)胞毒性藥物治療了快速生長(zhǎng)的乳腺癌細(xì)胞系，并使用儀器的EC和綠色熒光通道對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。組成性表達(dá)GFP蛋白的MDA-MB-231細(xì)胞用從156nM至20µM的Staurosporine和喜樹堿的1:2稀釋劑量-反應(yīng)曲線處理。Staurosporine是一種有效的蛋白激酶抑制劑，通過Caspase-3介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
如圖5A和5D所示，Staurosporine和喜樹堿均在6至12小時(shí)后達(dá)到峰值，隨后在接下來的3天內(nèi)緩慢但穩(wěn)定地下降，尤其是在高劑量下。使用CELLCYTE Studio軟件采集和分析熒光圖像，獲得綠色強(qiáng)度（圖5B和5E）和綠色物體計(jì)數(shù)指標(biāo)（圖5C和5F。事實(shí)上，這兩個(gè)參數(shù)對(duì)這些藥物的效果提供了一個(gè)互補(bǔ)的觀點(diǎn)。
Staurosporine處理的細(xì)胞(圖5B)的綠色強(qiáng)度反映了GFP的整體表達(dá)程度，在最初的6- 12小時(shí)內(nèi)保持不變，并穩(wěn)步下降，而對(duì)照處理的細(xì)胞則顯示出6倍的增長(zhǎng)。對(duì)于喜樹堿，在3個(gè)數(shù)據(jù)中，細(xì)胞表現(xiàn)出更微妙的劑量依賴性恒定動(dòng)力學(xué)(圖5E)。第三個(gè)感興趣的指標(biāo)是綠色物體計(jì)數(shù)，與強(qiáng)度相反，Staurosporine（圖5C）比喜樹堿（圖5F）表現(xiàn)出更顆粒的劑量依賴性行為。
這3個(gè)指標(biāo)提供了一組不同但互補(bǔ)的定量測(cè)量，可以通過檢查采集和分析的圖像進(jìn)行協(xié)調(diào)。
經(jīng)Staurosporine處理的細(xì)胞在10小時(shí)后呈現(xiàn)出明顯的星狀形態(tài)(圖6)。因此EC -匯流掩膜(圖6)高估了總體占據(jù)面積的增加。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞生長(zhǎng)確實(shí)受到了抑制，盡管有星形形態(tài)，但EC融合度指標(biāo)仍然可以觀察到廣泛的細(xì)胞死亡，該指標(biāo)描述了前10小時(shí)后的穩(wěn)定下降。
在這種情況下，需要考慮的補(bǔ)充指標(biāo)是熒光信號(hào)。當(dāng)檢查綠色熒光時(shí)，Staurosporine處理的細(xì)胞中凋亡小體中GFP的積累解釋了綠色物體數(shù)量的增加，如圖5C和圖6所示。在接下來的幾天里，隨著膜完整性的完全喪失和壞死，熒光物數(shù)量以一種更依賴劑量的方式迅速減少，在staurosporin處理的細(xì)胞中，72小時(shí)后可以看到最小的信號(hào)(圖6)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究已經(jīng)證明，高通量活細(xì)胞成像平臺(tái)CELLCYTE X™可以為藥理學(xué)篩選提供自動(dòng)化的、連續(xù)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)分析:
參考文獻(xiàn)
1. Lawana V, Korrapati MC, Mehendale HM. Cycloheximide. In Wexler P,ed. Encyclopedia of Toxicology. 3rd ed. Academic Press; 2014: 1103–1105. DOI:10.1016/B978-0-12-386454-3.00298-0.
2. DrugBank Online. Camptothecin. Accessed 12 October 2021. https://go.drugbank.com/drugs/DB04690.
3. Eidet JR, Pasovic L, Maria R, et al. Objective assessment of changes in nuclear morphology and cell distribution following induction of apoptosis. Diagnostic Pathology. 2014; 9(1): 92. DOI:10.1186/1746-1596-9-92.
4. Deshmukh M, Johnson EM. Staurosporine-induced neuronal death: multiple mechanisms and methodological implications. Cell Death & Differentiation. 2000; 7(3): 250–261. DOI:10.1038/sj.cdd.4400641.
5. Yang R, Fu W, Wang S, et al. Mechanism of the morphological changes induced by staurosporine in rat osteoblasts. Calcified Tissue International. 1997; 61: 68–73. DOI:10.1007/s002239900297.
6. Tharanga Jayasooriya R, Gayani Dilshara M, Neelaka Molagoda I,et al. Camptothecin induces G2/M phase arrest through the ATM-Chk2-Cdc25C axis as a result of autophagy-induced cytoprotection: Implications of reactive oxygen species. Oncotarget. 2018; 9(31): 21744–21757.DOI:10.18632/oncotarget.24934.
本文中，我們將展示使用高通量活細(xì)胞成像平臺(tái)CELLCYTE X™如何方便地獲得多孔板中細(xì)胞的全面、長(zhǎng)時(shí)間、多參數(shù)和實(shí)時(shí)的狀態(tài)，并證實(shí)，CELLCYTE X™基于輪廓增強(qiáng)的細(xì)胞匯合百分比與熒光信號(hào)強(qiáng)度和核或細(xì)胞計(jì)數(shù)指標(biāo)相結(jié)合，可成功用于表征藥物在人和鼠不同細(xì)胞類型中的藥理學(xué)特征。
CELLCYTE X 在藥理學(xué)篩選中的應(yīng)用
實(shí)驗(yàn)背景
細(xì)胞增殖是基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究，尤其是免疫腫瘤學(xué)應(yīng)用藥物發(fā)現(xiàn)中的關(guān)鍵指標(biāo)。細(xì)胞增殖的變化通常通過終點(diǎn)測(cè)定來評(píng)估，例如通過核苷類似物BrdU和EdU的摻入來定量DNA合成，或通過分析增殖報(bào)告蛋白的表達(dá)，例如Ki-67和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）。但在近來20年，活細(xì)胞成像已被證實(shí)是評(píng)估細(xì)胞增殖的一種更加優(yōu)越的技術(shù)，因?yàn)樗蕾囉谠谂囵B(yǎng)箱中數(shù)天或數(shù)周的生長(zhǎng)細(xì)胞圖像的采集和分析，從而提供受控的、一致的環(huán)境條件下細(xì)胞群的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。
在此，我們演示了CELLCYTE X™如何使用多個(gè)參數(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖，詳細(xì)介紹如何通過使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）中的無標(biāo)記融合測(cè)量或通過表達(dá)熒光團(tuán)細(xì)胞的多參數(shù)分析，定量和定性評(píng)估不同藥物的藥理學(xué)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 細(xì)胞增殖的多參數(shù)分析
以CELLCYTE X™增強(qiáng)輪廓（EC）的高對(duì)比度亮場(chǎng)形式和綠色（綠色FL）、紅色（紅色FL）熒光通道對(duì)生長(zhǎng)中的視網(wǎng)膜色素上皮-1（RPE-1）細(xì)胞成像，分別監(jiān)測(cè)核和細(xì)胞質(zhì)熒光團(tuán)的表達(dá)。然后使用CELLCYTE X軟件同時(shí)分析這些圖像，以便以EC匯合百分比、綠色FL細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅色FL細(xì)胞核計(jì)數(shù)的形式推斷細(xì)胞增殖的定量測(cè)量（圖1）。
同時(shí)測(cè)量多個(gè)熒光信號(hào)的能力使CELLCYTE X™成為實(shí)時(shí)分析共培養(yǎng)系統(tǒng)的理想平臺(tái)（圖2）。
通過使用熒光匯流面積百分比衡量指標(biāo)，分析表達(dá)綠色或紅色熒光團(tuán)的乳腺癌細(xì)胞系的增殖情況(圖2B)。每個(gè)視場(chǎng)的熒光物體計(jì)數(shù)表明GFP表達(dá)細(xì)胞具有優(yōu)越的增殖能力（圖2C）。熒光強(qiáng)度(a.u)指標(biāo)更全面地反映了個(gè)體細(xì)胞隨時(shí)間的增殖行為（圖2D和2E）。實(shí)際上，總體紅色熒光強(qiáng)度表明，盡管表達(dá)mCherry的細(xì)胞增殖較低，但熒光信號(hào)強(qiáng)度與GFP信號(hào)相當(dāng)（圖2D）。這可以通過單個(gè)熒光指標(biāo)來解釋，可以從圖2E中所示的隨時(shí)間變化的種群平均水平進(jìn)行分析，也可以從圖2F中所示的所有圖像的單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行分析，證實(shí)了表達(dá)mcherry的細(xì)胞數(shù)量較少，但與表達(dá)GFP的細(xì)胞相比，它們發(fā)出的熒光信號(hào)卻更強(qiáng)烈。
使用CELLCYTE X Studio Software，用戶還可以調(diào)整熒光掩膜靈敏度，只檢測(cè)表達(dá)一定熒光團(tuán)水平的細(xì)胞，這在培養(yǎng)表現(xiàn)不同表達(dá)程度的異質(zhì)細(xì)胞群體時(shí)非常有用。通過利用這些指標(biāo)，可以在高通量設(shè)計(jì)中解釋可變熒光團(tuán)表達(dá)，如應(yīng)用在CRISPR/Cas9 gRNA文庫或facs排序細(xì)胞的基因篩選中。
2. 抑制細(xì)胞增殖藥物的無標(biāo)記劑量反應(yīng)分析
劑量反應(yīng)分析是評(píng)估藥物研發(fā)過程中各種化合物作用的關(guān)鍵工具，特別是在評(píng)估藥物對(duì)不同類型細(xì)胞增殖的影響時(shí)。CELLCYTE X™增強(qiáng)輪廓成像方式是一種高對(duì)比度亮場(chǎng)顯微鏡，可用于獲得精確的無標(biāo)記細(xì)胞匯流測(cè)量。
為了驗(yàn)證細(xì)胞匯合衡量指標(biāo)對(duì)高通量篩選平臺(tái)的適用性，我們監(jiān)測(cè)了在96孔板中用Cycloheximide（一種常用的細(xì)胞毒性蛋白合成抑制劑）和喜樹堿（一種DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑）處理的MEF細(xì)胞的增殖情況。
為了評(píng)估EC匯流衡量指標(biāo)的敏感性和粒度的可譯性，我們獲得這兩種藥物的1:3稀釋劑量-反應(yīng)曲線，覆蓋從0.123 μ M到10 μ M 2-log的濃度范圍。喜樹堿和Cycloheximide治療均獲得了穩(wěn)健的化合物濃度依賴性劑量反應(yīng)（圖3）。喜樹堿處理的MEF，特別是在較低劑量時(shí)，顯示出在應(yīng)用該化合物后的前6小時(shí)內(nèi)匯合度增加。隨后，細(xì)胞毒性作用很快顯現(xiàn)出來。在濃度為0.123µM時(shí)，細(xì)胞匯合穩(wěn)定下降，在濃度為1.11µM至10µM的情況下，匯合呈動(dòng)力學(xué)等效指數(shù)下降（圖3A）。另一方面，經(jīng)Cycloheximide處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更大范圍的細(xì)胞毒性動(dòng)力學(xué)。雖然在前3小時(shí)內(nèi)也觀察到匯合度略有增加，但隨后是一個(gè)較慢且較穩(wěn)定的下降，在濃度峰值時(shí)看到的動(dòng)力學(xué)更快(圖3B)。
這些化合物的不同效力反映在它們的IC50中，該濃度是用48小時(shí)的細(xì)胞匯合數(shù)據(jù)計(jì)算的。MEF細(xì)胞顯然對(duì)喜樹堿（IC50=0.15µM，CI95 0.12–0.17µM）比Cycloheximide（IC50=1.15µM，CI95 1.03–1.48）更敏感（圖3C）。
這一定量數(shù)據(jù)表明Cycloheximide的藥理學(xué)窗口更寬，也反映在定性形態(tài)學(xué)變化中，可以通過CELLCYTE X™生成的高分辨率EC圖像進(jìn)行識(shí)別（圖4）。雖然在1.11 μ M下，兩種藥物在6小時(shí)內(nèi)似乎都不會(huì)影響典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，但在48小時(shí)內(nèi)卻有明顯的差異。使用喜樹堿，可以通過四舍五入的高對(duì)比度細(xì)胞的形式看到廣泛的細(xì)胞死亡。
為了更準(zhǔn)確地反映藥物的細(xì)胞毒性，用于EC合流定量的掩膜被設(shè)置為不識(shí)別大量碎片(圖4，右中)。另一方面，Cycloheximide引起的蛋白質(zhì)合成抑制不僅表現(xiàn)為EC匯合所量化的中度增殖抑制，而且在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為高對(duì)比度核周結(jié)構(gòu)的廣泛積累（圖4，右下角），這些特征可以通過高分辨率EC圖像來識(shí)別。
3. 使用增強(qiáng)型輪廓匯流和熒光通道衡量指標(biāo)的復(fù)合物篩選
前瞻性抗增殖藥物庫的篩選通常通過高通量設(shè)置中的分析來完成，其中單個(gè)指標(biāo)反映了在預(yù)定終點(diǎn)對(duì)細(xì)胞健康的不同測(cè)量。通過使用CELLCYTE X™的增強(qiáng)輪廓和熒光成像模式，可以使用多種指標(biāo)實(shí)時(shí)評(píng)估藥物治療對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
為了驗(yàn)證CELLCYTE X™在合理準(zhǔn)確量化細(xì)胞增殖方面的能力，我們用廣泛濃度的細(xì)胞毒性藥物治療了快速生長(zhǎng)的乳腺癌細(xì)胞系，并使用儀器的EC和綠色熒光通道對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。組成性表達(dá)GFP蛋白的MDA-MB-231細(xì)胞用從156nM至20µM的Staurosporine和喜樹堿的1:2稀釋劑量-反應(yīng)曲線處理。Staurosporine是一種有效的蛋白激酶抑制劑，通過Caspase-3介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
如圖5A和5D所示，Staurosporine和喜樹堿均在6至12小時(shí)后達(dá)到峰值，隨后在接下來的3天內(nèi)緩慢但穩(wěn)定地下降，尤其是在高劑量下。使用CELLCYTE Studio軟件采集和分析熒光圖像，獲得綠色強(qiáng)度（圖5B和5E）和綠色物體計(jì)數(shù)指標(biāo)（圖5C和5F。事實(shí)上，這兩個(gè)參數(shù)對(duì)這些藥物的效果提供了一個(gè)互補(bǔ)的觀點(diǎn)。
Staurosporine處理的細(xì)胞(圖5B)的綠色強(qiáng)度反映了GFP的整體表達(dá)程度，在最初的6- 12小時(shí)內(nèi)保持不變，并穩(wěn)步下降，而對(duì)照處理的細(xì)胞則顯示出6倍的增長(zhǎng)。對(duì)于喜樹堿，在3個(gè)數(shù)據(jù)中，細(xì)胞表現(xiàn)出更微妙的劑量依賴性恒定動(dòng)力學(xué)(圖5E)。第三個(gè)感興趣的指標(biāo)是綠色物體計(jì)數(shù)，與強(qiáng)度相反，Staurosporine（圖5C）比喜樹堿（圖5F）表現(xiàn)出更顆粒的劑量依賴性行為。
這3個(gè)指標(biāo)提供了一組不同但互補(bǔ)的定量測(cè)量，可以通過檢查采集和分析的圖像進(jìn)行協(xié)調(diào)。
經(jīng)Staurosporine處理的細(xì)胞在10小時(shí)后呈現(xiàn)出明顯的星狀形態(tài)(圖6)。因此EC -匯流掩膜(圖6)高估了總體占據(jù)面積的增加。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞生長(zhǎng)確實(shí)受到了抑制，盡管有星形形態(tài)，但EC融合度指標(biāo)仍然可以觀察到廣泛的細(xì)胞死亡，該指標(biāo)描述了前10小時(shí)后的穩(wěn)定下降。
在這種情況下，需要考慮的補(bǔ)充指標(biāo)是熒光信號(hào)。當(dāng)檢查綠色熒光時(shí)，Staurosporine處理的細(xì)胞中凋亡小體中GFP的積累解釋了綠色物體數(shù)量的增加，如圖5C和圖6所示。在接下來的幾天里，隨著膜完整性的完全喪失和壞死，熒光物數(shù)量以一種更依賴劑量的方式迅速減少，在staurosporin處理的細(xì)胞中，72小時(shí)后可以看到最小的信號(hào)(圖6)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究已經(jīng)證明，高通量活細(xì)胞成像平臺(tái)CELLCYTE X™可以為藥理學(xué)篩選提供自動(dòng)化的、連續(xù)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞生長(zhǎng)分析:
- EC匯合率、細(xì)胞核計(jì)數(shù)和細(xì)胞計(jì)數(shù)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖。
- 多個(gè)熒光通道可在共培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行靈活的細(xì)胞增殖分析。
- 通過定性形態(tài)學(xué)分析以及EC合流率、熒光強(qiáng)度信號(hào)和熒光物計(jì)數(shù)的定量測(cè)量，實(shí)現(xiàn)了全面的藥理評(píng)價(jià)。
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