Appbp2基因敲除小鼠在如何增加改善代謝健康的脂肪細(xì)胞研究中的應(yīng)用

脂肪組織可通過分泌激素來調(diào)節(jié)饑餓和體溫，在身體的關(guān)鍵功能中發(fā)揮積極作用。體內(nèi)的脂肪有很多種：白色脂肪組織可儲(chǔ)存多余的能量，而棕色脂肪組織則消耗能量并產(chǎn)熱。米色脂肪則是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪組織，與棕色脂肪一樣具有產(chǎn)熱功能。

越來越多的證據(jù)表明，棕色和米色脂肪組織可以預(yù)防代謝疾病，比如胰島素抵抗和糖尿病。米色脂肪的增加與代謝健康的顯著改善有關(guān)。近日，哈佛醫(yī)學(xué)院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心等機(jī)構(gòu)的研究人員開發(fā)出一種新方法來產(chǎn)生更多的米色脂肪細(xì)胞。

作者鑒定出一種關(guān)鍵的E3泛素連接酶Cul2-APPBP2，它能夠催化PRDM16蛋白的降解，而PRDM16蛋白是米色脂肪產(chǎn)生的有效激活因子。這項(xiàng)研究成果于8月17日發(fā)表在《Nature》雜志上。
 

圖片來源：Nature

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用Cul2^flox/−小鼠、Appbp2^flox/−小鼠以及Appbp2（S561N）點(diǎn)突變小鼠（后兩種小鼠由賽業(yè)生物提供）來構(gòu)建脂肪細(xì)胞特異性的Cul2-KO小鼠和Appbp2-KO小鼠。作者還采用shRNA干擾和過表達(dá)技術(shù)來分析Cul2和Appbp2基因的功能。在分析PRDM16蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制時(shí)，作者綜合使用了蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)互作分析等方法。

技術(shù)路線
01 脂肪細(xì)胞中的CUL2降低PRDM16蛋白的穩(wěn)定性
02 脂肪細(xì)胞中CUL2的缺失改善代謝健康
03 APPBP2作為CUL2–RING E3連接酶復(fù)合物中的底物受體
04 CUL2–APPBP2復(fù)合物催化PRDM16蛋白的多泛素化和降解
05 APPBP2控制全身能量代謝

研究結(jié)果
1.CUL2降低了PRDM16蛋白的穩(wěn)定性
多項(xiàng)研究表明，PR結(jié)構(gòu)域蛋白16（the positive regulatory domain containing 16, PRDM16）通過與轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳因子形成復(fù)合物來促進(jìn)米色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)生，因此成為改善代謝健康的熱門靶點(diǎn)。然而，由于缺乏對(duì)PRDM16蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制的了解，選擇性靶向該通路來改善代謝變得很困難，于是研究人員試圖探索PRDM16蛋白的降解機(jī)制。

作者觀察到，NEDD8活化酶抑制劑MLN4924能夠大幅提高PRDM16蛋白水平，而不是mRNA水平；MLN4924是一種小分子抑制劑，能夠抑制蛋白質(zhì)neddylation（類泛素化）修飾，這種修飾通過NEDD8靶向cullin–RING E3泛素連接酶復(fù)合體等來刺激泛素連接酶的活性。因此，作者開始尋找PRDM16蛋白的E3泛素連接酶復(fù)合物。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在cullin–RING E3泛素連接酶家族成員（CUL1-7）中，只有CUL2和PRDM16的共表達(dá)才會(huì)導(dǎo)致PRDM16蛋白表達(dá)的降低，而不影響Prdm16 mRNA水平。此外，放線菌酮追蹤實(shí)驗(yàn)表明，Cul2缺失顯著延長了PRDM16蛋白的半衰期，同時(shí)Cul2缺失對(duì)PRDM16蛋白的穩(wěn)定的影響顯著改變了脂肪細(xì)胞中的代謝級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但不影響脂肪生成。后續(xù)的RNA-seq分析表明，Cul2缺失可以促進(jìn)PRDM16激活線粒體呼吸作用、脂肪酸氧化和支鏈氨基酸降解等在棕色/米色脂肪生命過程十分重要的反應(yīng)，同時(shí)抑制脂肪組織炎癥和纖維化。這些結(jié)果顯示，CUL2的存在會(huì)降低PRDM16蛋白的穩(wěn)定性。

接下來，作者想確定脂肪細(xì)胞中的CUL2–RING E3連接酶可在多大程度上調(diào)節(jié)全身的能量代謝。作者構(gòu)建了脂肪特異性的Cul2敲除（Adipo-Cul2-KO）小鼠。與對(duì)照相比，Adipo-Cul2-KO小鼠在高脂飲食后表達(dá)更高水平的PRDM16蛋白。脂肪細(xì)胞特異性的Cul2缺失抵消了高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗和血脂異常。這些結(jié)果表明，脂肪中CUL2的缺失可改善代謝健康。

2.APPBP2是連接CUL2和PRDM16的底物特異性受體
CUL2主要通過與幾種底物受體相互作用來發(fā)揮支架蛋白功能。為了鑒定PRDM16蛋白的特異性底物受體，研究人員對(duì)分化的米色脂肪細(xì)胞中的CUL2復(fù)合物進(jìn)行免疫純化，并利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC–MS/MS）對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析和shRNA篩選，發(fā)現(xiàn)APPBP2的下調(diào)顯著提高了分化脂肪細(xì)胞中Ucp1 mRNA水平，該基因編碼了負(fù)責(zé)產(chǎn)熱的線粒體膜蛋白。

之后，作者開展了多個(gè)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證CUL2–APPBP2催化PRDM16蛋白多泛素化的假設(shè)。蛋白質(zhì)互作實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，APPBP2通過與ELOB和ELOC的相互作用與CUL2互作，而APPBP2直接與PRDM16相互作用。多泛素化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)以及質(zhì)譜和點(diǎn)突變分析證實(shí)了CUL2–APPBP2特異性催化PRDM16多泛素化。Appbp2的缺失減少了PRDM16多泛素化并顯著延長了PRDM16蛋白的半衰期（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，APPBP2是CUL2–RING E3連接酶復(fù)合物催化PRDM16的多泛素化和降解過程中的底物受體。
 

圖1 CUL2–APPBP2催化PRDM16的多泛素化^[1]
 

在接下來的實(shí)驗(yàn)中，作者驗(yàn)證了脂肪細(xì)胞特異性的APPBP2抑制促進(jìn)米色脂肪產(chǎn)生的假設(shè)。作者委托賽業(yè)生物構(gòu)建了Appbp2 floxed小鼠，并與Adiponectin-Cre小鼠雜交后產(chǎn)生脂肪細(xì)胞特異性的Appbp2敲除（Adipo-Appbp2-KO）小鼠。Appbp2缺失導(dǎo)致PRDM16蛋白水平升高，并伴隨著棕色/米色脂肪選擇性基因的表達(dá)增加。與對(duì)照相比，Appbp2-KO脂肪細(xì)胞表達(dá)更高水平的線粒體編碼基因。此外，研究人員還通過蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和細(xì)胞呼吸分析這三個(gè)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CUL2-APPBP2催化PRDM16蛋白多泛素化的底物特異性。

3.美普他酚可增強(qiáng)抗病毒免疫力
在確定CUL2–APPBP2為PRDM16的E3泛素連接酶之后，作者進(jìn)一步分析了PRDM16蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制。之前的研究表明EHMT1會(huì)調(diào)控PRDM16蛋白的穩(wěn)定性和棕色/米色脂肪細(xì)胞的發(fā)育，在本文作者發(fā)現(xiàn)EHMT1通過PRDM16的蛋白結(jié)合界面以劑量依賴性的方式從PRDM16復(fù)合物中置換出APPBP2。重要的是，復(fù)合物中APPBP2的置換減少了PRDM16蛋白的多泛素化。同時(shí)，老年脂肪組織中的APPBP2和CUL2表達(dá)升高，而PRDM16和UCP1蛋白的表達(dá)則下降（圖2）。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，APPBP2可能在代謝健康中發(fā)揮作用。于是，研究人員分析了Adipo-Appbp2-KO小鼠在高脂飲食后的代謝表型。作者發(fā)現(xiàn)，Appbp2-KO小鼠的體重明顯低于對(duì)照小鼠，且脂滴積累更少。與對(duì)照相比，這些小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性增加，而且肝臟中的甘油三酯水平更低。這些結(jié)果表明，脂肪組織中CUL2-APPBP2的缺失可防止飲食引起的肥胖、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗和血脂異常。
 

圖2 APPBP2控制全身能量代謝^[1]

研究結(jié)論
總的來說，這項(xiàng)研究提出了通過PRDM16蛋白穩(wěn)定性來控制米色脂肪產(chǎn)生的模型：CUL2–APPBP2 E3泛素連接酶復(fù)合物催化了PRDM16蛋白的多泛素化和降解（圖2i）。CUL2–APPBP2的抑制延長了PRDM16蛋白的半衰期，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中產(chǎn)熱基因的自主激活以及促炎/纖維化基因的抑制。研究人員認(rèn)為，在各種病理生理狀況下如何調(diào)控CUL2–APPBP2–PRDM16的相互作用是未來研究的重要課題。

原文檢索：
[1]Wang, Q., Li, H., Tajima, K. et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature 609, 151–158 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05067-4
 

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建
 

賽業(yè)生物構(gòu)建了Appbp2基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠，更有活體小鼠已加入『紅鼠資源庫』，快至2周交付！確保您在短時(shí)間內(nèi)獲得更具性價(jià)比的實(shí)驗(yàn)用鼠，為您的研究加點(diǎn)速~

Appbp2基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Appbp2^em1Cya
品系編號(hào)：
KOCMP-66884-Appbp2-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-KO-11974
應(yīng)用方向：
免疫系統(tǒng)、皮膚、視力/眼睛
打靶方案：

Appbp2條件性基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Appbp2^em1(flox)Cya
品系編號(hào)：
CKOCMP-66884-Appbp2-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-13362
應(yīng)用方向：
免疫系統(tǒng)、皮膚、視力/眼睛
打靶方案：