Affinité P4SPR儀器快速檢測抗體活性的實驗流程及結(jié)果分析

抗體的質(zhì)量受pH、溫度、和細胞培養(yǎng)代謝物等工藝參數(shù)的影響[1]。抗體等生物藥需要進行質(zhì)量控制，以確保質(zhì)量和安全。這些生物藥不僅需要通過串聯(lián)質(zhì)譜等物理化學方法進行表征，而且還必須研究它們的生物活性。傳統(tǒng)方法例如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）[1] [2]）被用于活性測定。然而，這些檢測不能提供動力學和親和力數(shù)據(jù)[1]。另一種方法是表面等離子體共振（SPR）技術(shù)。SPR是一種表征蛋白質(zhì)的強大技術(shù)，作為一種無標記技術(shù)，利用它可以實時檢測蛋白質(zhì)相互作用，并且樣品使用量少[2]。大型SPR系統(tǒng)已被用于蛋白質(zhì)質(zhì)量控制[2] [3]。盡管如此，大型SPR設備的使用仍然有限，儀器需專人使用，操作復雜，耗材成本高[4]。另一方面，個人型SPR設備可以讓科學家快速的檢測樣品，輕松獲得驗證質(zhì)量所需的有價值的動力學和親和力數(shù)據(jù)，而不影響靈敏度和特異性。

在本應用中，我們演示了如何使用個人型SPR設備（P4SPR™）輕松確定哪種來源的抗核衣殼抗體與SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白具有最佳的結(jié)合性能。

實驗流程

 

Djaileb等人在ChemRXiv論文中描述了更詳細的實驗過程[6]。圖1顯示了固定SARS-CoV-2核衣殼蛋白檢測抗核衣殼抗體的方案。通常，金傳感器表面用Afficoat[4]修飾。用EDC / NHS處理，然后用醋酸鈉洗滌。將SARS-CoV-2核衣殼重組（rN）蛋白溶液（10μg/ mL）添加到表面并處理20分鐘；再次用醋酸鈉洗滌。蛋白質(zhì)修飾的表面被1M乙醇胺封閉10分鐘（pH 8.5）以減少非特異性吸附。通過運行緩沖液（RB）對其進行平衡。隨后，將來自不同來源的抗體制造商的抗核衣殼抗體溶液（10 μg/mL）（表1）手動注入傳感器，并在每個通道（圖2，通道A-C）收集SPR響應信號，一次進樣獲得3次重復試驗數(shù)據(jù)。在引入新的抗體溶液之前，使用運行緩沖液和甘氨酸溶液進行洗滌。使用AntiRBD（受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域）作為對照（圖2，通道D），以校正溫度和體折射率的任何波動。SPR偏移的差異根據(jù)測量開始到結(jié)束的共振單位（RU）差異確定[6]。
 

結(jié)果和討論

整個實驗測試4種不同來源的抗體抗核衣殼所花費的總時間2.5小時。每次注射的平均時間約為18分鐘，注射和再生的平均總時間為25分鐘。
 

圖3顯示了所有3個樣品通道中抗核衣殼抗體第一和第二來源的SPR響應�？梢郧宄�地看到抗核衣殼抗體與SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白的互作響應。
 

圖4顯示了所有四次進樣的平均信號曲線圖。
 

圖5顯示了各種來源（按進樣順序）的抗核衣殼抗體（即淺藍色的RU強度）互作強弱。很明顯，AB1，批次B（注射#2）表現(xiàn)出最高的SPR響應或活性。此外，值得注意的是，如果使用濃度梯度的抗體或分析物，還可以通過手動進樣輕松確定解離平衡常數(shù)（KD），例如[參見應用筆記– 基因調(diào)控，Lac操縱子/Lac阻遏因子（DNA-蛋白結(jié)合）]/（或者將這篇文章的鏈接放這兒）。

P4SPR優(yōu)勢

Affinité 儀器的 P4SPR™ 是一種用戶友好型儀器，可用于對蛋白質(zhì)進行一般質(zhì)量控制。無論蛋白質(zhì)供應來自新供應商還是已經(jīng)儲存了一段時間，P4SPR™都可以輕松區(qū)分高活性和低活性蛋白質(zhì)。此外，抗體樣品不需要復雜的樣本制備，可以稀釋后直接注射樣到儀器中。由于其多通道的功能設計，P4SPR 可提供快速、實時的數(shù)據(jù)和精度。

結(jié)論
很明顯，個人型SPR儀器可以快速對抗體進行質(zhì)控，從而選擇哪種抗體更適合于下一步的實驗。這樣可有效保障研究者的實驗進展。同時，P4SPR也為生物制藥產(chǎn)品進行質(zhì)量控制提供了一種快速簡便的方案。

參考文獻
1. M. Zschatzsch, Paul Ritter, Anja Henseleit,Klaus Wiehler, Sven Malik, Thomas Bley,Thomas Walther, Elke Boschke, "Monitoringbioactive and total antibody concentrationsfor continuous process control by surfaceplasmon resonance spectroscopy," Eng. LifeSci., vol. 19, pp. 681-690, 2019.

2. Pranavan Thillaivinayagalingam, JulienGommeaux, Michael McLoughlin, DavidCollins, Anthony R. Newcombe,"Biopharmaceutical production: Applicationsof surface plasmon resonance biosensors," J.Chromatogr. B, vol. 878, pp. 149-153, 2010.

3. C. Gassner, F. Lipsmeier, P. Metzger, H. Beck, A.Schnueriger, J.T. Regula, J. Moelleken,"Development and validation of a novel SPRbased assay principle for bispecific molecules,"J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 102, pp. 144-149,2015.

4. "Affinité Instruments," [Online]. Available:https://affiniteinstruments.com/

5. H. Wang, Jing Shi, Youchun Wang, Kun Cai, QinWang, Xiaojun Hou, Wei Guo, Feng Zhang,"Development of biosensor-based SPRtechnology for biological quantification andquality control of pharmaceutical proteins," J.Pharm. Biomed. Anal., vol. 50, pp. 1026-1029,2009.

6. Abdelhadi Djaileb, Benjamin Charron, MaryamHojjat Jodaylami, Vincent Thibault, JulienCoutu, Keisean Stevenson, Simon Forest,Ludovic S. Live, Denis Boudreau, Joelle N.Pelletier, Jean-Francois Masson, "A Rapid and Quantitative Serum Test for SARS-CoV-2 Antibodies with Portable Surface Plasmon Resonance Sensing,"http://doi.org/10.26434/chemrxiv.12118914.v1, April 15, 2020.