P4SPR分子互作儀的八種常見應(yīng)用及優(yōu)勢

用于快速檢測的表面等離子共振儀器——P4SPR是一款非常便利與研究人員快速開發(fā)生物測定方法和進行生物分子相互作用特征分析的日常工具。

下面簡單介紹一下P4SPR的常見應(yīng)用以及在應(yīng)用上的優(yōu)勢。

一 DNA-蛋白檢測——基因調(diào)控-Lac操縱子/Lac阻遏物

乳糖操縱子（LacO）是參與乳糖分解的一個基因群，調(diào)控乳糖代謝相關(guān)基因的表達，乳糖阻遏物（LacI）作為一種DNA-結(jié)合蛋白，是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵。

利用P4SPR可以測定LacO/LacI體系的結(jié)合強度（親和力，KD），其儀器使用簡單，操作界面友好，非常適合實驗室技術(shù)人員開發(fā)和本科課程教學(xué)。
 

圖 1 SPR信號在不同濃度LacO下隨時間的變化
 

圖 2 增加LacI濃度時的疊加結(jié)合曲線
 

P4SPR成功地表征了Lac操縱子DNA及其抑制蛋白的結(jié)合相互作用，該系統(tǒng)也可以作為表征其他生物系統(tǒng)的有用工具，比如DNA-DNA、DNA-RNA和適配體等。

P4SPR的優(yōu)勢還體現(xiàn)在它具有獨特的模塊化、可移動性和多通道設(shè)計，用于藥物發(fā)現(xiàn)、生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用。并且?guī)缀醪恍枰獦悠分苽�，可以快速和簡單的進行系統(tǒng)設(shè)置，同時還可以節(jié)省用戶的試劑成本。

二 小分子檢測——在環(huán)境水域中進行RDX的現(xiàn)場測試

環(huán)三亞甲基三硝銨（RDX）廣泛用于彈藥制造，也是爆炸污染的主要成分。

目前，對于RDX的檢測通常采用實驗室的HPLC-UV檢測法，雖然這種方法十分靈敏，但是因為它需要在測試之前進行取樣、運輸、儲存和樣品準(zhǔn)備等工作，因此耗時較長，需要幾天甚至幾周的時間。而利用P4SPR的便攜性可以直接到現(xiàn)場檢測RDX，儀器只需要進行簡單的現(xiàn)場布置就能使用，并且能夠直接檢測，不需要樣品制備，檢測時間通常只需要幾個小時。
 

P4SPR為RDX的現(xiàn)場檢測提供了卓越的分析能力。它的便攜性和穩(wěn)定性使其適用于各種環(huán)境條件下的現(xiàn)場測試，因此還可以廣泛適用于其他污染物的檢測。

三 蛋白質(zhì)-小分子相互作用——跨膜蛋白（TM）的作用機制
CD36是具有多種功能的跨膜蛋白的一部分，它在脂質(zhì)攝取、細(xì)胞粘附和病原體感知方面有多種作用。配體/CD36蛋白的相互作用可能介導(dǎo)生物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。P4SPR具有無標(biāo)簽傳感和實時監(jiān)測的特點，這在研究生物分子相互作用以闡明通路方面表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。
 

圖 6 評估與CD36傳感器芯片的小分子相互作用的SPR方法的示意圖
 

圖 7 指示化合物的KD和最大SPR信號（ΔλSPR,max）

P4SPR為了解跨膜蛋白與信息素刺激的作用機制提供了幫助，并且模塊化設(shè)計提供了微流控系統(tǒng)，多通道特性提高了結(jié)果的精度，高靈敏度也允許檢測低分子量的小分子物質(zhì)，加上友好的操作界面，P4SPR非常適用于快速獲取實時數(shù)據(jù)來表征分子間結(jié)合的相互作用。

四 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用
急性淋巴母細(xì)胞白血�。ˋLL）是一種疾病，大腸桿菌l-天冬酰胺酶（EcAII）作為一種生物治療藥物是被證明對ALL有效的主要化療藥物之一。而患者可以通過產(chǎn)生抗體來中和EcAII，從而降低治療效率。通過P4SPR可以有效檢測抗體并且P4SPR具有可重復(fù)的傳感器效率這一特點。

圖 8 EcAII受體的固定化和免疫傳感性能綜述
 

圖 9 EcAII變體的固定化。在注射40 μg蛋白（0.1mgmL−1）的腎折疊酶（黑色）或his標(biāo)記的EcAII：N21-EcAII（綠色）、N26-EcAII（藍色）和C8-EcAII（紅色）后，觀察EcAII變體表面固定的SPR傳感器圖

P4SPR操作的簡易性可以讓實驗者快速評估分析參數(shù)，比如固定化方法對受體表面覆蓋的影響以及傳感效率。它的多通道性也提高了結(jié)果的精度，而且具有高靈敏度，非常有利于生物樣本中的生物治療藥物的分析。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）技術(shù)相比，P4SPR無需對樣品進行標(biāo)記預(yù)處理，并且使用試劑的量更少，制備步驟更簡潔，可以減少檢測的時間和試劑的成本。

五 抗體的快速質(zhì)量檢控
在進行抗體的質(zhì)量檢控時，傳統(tǒng)的ELISA通常只能進行終點分析，而不能提供動力學(xué)和親和力數(shù)據(jù)，表面等離子共振（SPR）技術(shù)可以實時評估蛋白質(zhì)的相互作用并且不需要太多的樣品制備。

P4SPR作為一種便攜式的SPR設(shè)備可以讓科學(xué)家更加快速并且容易地獲得有價值的動力學(xué)和親和力數(shù)據(jù)以驗證質(zhì)量，而不影響靈敏度和結(jié)合特異性。例如應(yīng)用P4SPR可以輕松確定哪種抗體與SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白具有最好的結(jié)合性能。
 

圖 10 固定化SARS-CoV-2核衣殼蛋白檢測抗核衣殼抗體的方案
 

圖 11 第一次和第二次注射，同時從每個通道（綠色、紅色、黑色）收集傳感器圖。參考通道為藍色
 

圖 12 所有3個通道（洋紅色）的平均傳感器圖，參考通道為藍色，每個傳感器圖代表了抗核衣殼抗體的不同來源

由于其檢測的高精度和靈敏性，所以無論檢測的蛋白是新的還是儲存了一段時間，P4SPR都可以很好的區(qū)分其高活性和低活性，并且不需要太多的抗體樣品制備，可以直接注射到儀器中，能快速確定哪個抗體源應(yīng)該用于進一步的實驗。因此，P4SPR也為其他類型的生物制藥產(chǎn)品進行質(zhì)量控制提供了一個快速和簡單的替代方案。

六 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的快速篩選
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPIs）幾乎是幾乎每一個生物過程的核心。在當(dāng)對自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析時，就發(fā)現(xiàn)了幾十種相互作用。

而繪制生物體的相互作用圖譜是一項艱巨的任務(wù)。目前常用的高通量技術(shù)來繪制圖譜很費力并且容易產(chǎn)生假陽性。SPR技術(shù)可以很好的彌補這一不足。

例如腸桿菌素是一種小分子鐵螯合劑，其生物合成途徑由6種蛋白質(zhì)EntA-F組成。由于已經(jīng)確定EntB和EntE在這一生物合成途徑中相互作用，因此很可能有其他的PPIs發(fā)生。P4SPR可用于篩選參與大腸桿菌中腸桿菌素生物合成的PPIs。
 

圖 13 傳感器圖顯示了固定化蛋白質(zhì)和注射的配體之間發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用（紅色和白色），或沒有相互作用（綠色和藍色）

P4SPR還可以進行更多的PPI篩選，快速、準(zhǔn)確的PPI篩選能力非常有助于治療靶點的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)。

七 片段化合物與蛋白質(zhì)相互作用——藥物發(fā)現(xiàn)
基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)已被確定為一種識別小化合物的策略，可進一步發(fā)展為先導(dǎo)物和臨床候選物。平衡解離常數(shù)（KD）表明了一個片段（或配體）與在靶標(biāo)疾病中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力的程度，是一重要檢測參數(shù)。

傳統(tǒng)的微量熱泳動技術(shù)（MST）、核磁共振技術(shù)（NMR）和等溫滴定量熱法（ITC）經(jīng)常用于驗證潛在的片段篩選。但是MST需要熒光標(biāo)記，而疏水熒光團可能通過非特異性結(jié)合干擾配體-蛋白質(zhì)的相互作用；ITC的通量相對較低，需要大量的樣本，而且運行每個樣本可能需要幾個小時；NMR是一種無標(biāo)簽的方法，但只適合于評估較弱的粘合劑（mM到µM范圍）。

表面等離子體共振（SPR）作為輔助片段篩選驗證的新技術(shù)。雖然SPR需要目標(biāo)蛋白的固定化步驟，但它使用了低數(shù)量的樣本�？梢钥焖賹崟r確定配體-蛋白復(fù)合物的親和信息。P4SPR可以在不到2小時內(nèi)提供準(zhǔn)確的結(jié)果。
 

圖 14 在P4SPR中測定片段和固定在傳感器芯片上的his標(biāo)記蛋白之間的KD
 

圖 15 傳感器圖顯示了配體在40µM時與兩個通道中固定化蛋白的實時結(jié)合數(shù)據(jù)（紅色和白色曲線）
 

圖 16 通過繪制RU與µM中濃度的SPR變化來測定KD

P4SPR能夠快速評估片段和蛋白質(zhì)之間的KD。通過4個微流控通道，一次最多注射4個重復(fù)樣品可以獲得準(zhǔn)確的KD。相同濃度的樣品可以在相同的傳感器芯片上進行注射，從而降低消耗品成本。最重要的是，這些數(shù)據(jù)顯示了在自己的研究實驗室中，省去了預(yù)定的步驟，并且連接到我們的KNX2模塊可以測定Kon和Koff以提供動力學(xué)數(shù)據(jù)，這是藥物設(shè)計的重要參數(shù)。因此，P4SPR非常有助于藥物發(fā)現(xiàn)。

八 疫苗監(jiān)測——血凝素檢測
血凝素（HA）的含量是流感疫苗監(jiān)測的重要指標(biāo)。目前評估疫苗批次的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法是單徑向免疫擴散（SRID）試驗。雖然這一方法從1978年就開始使用，不過仍存在一定的局限性，首先它是一種離線的方法，需要將樣品從流水線取下進行單獨分析，其次，SRID所需的參考血清和抗原試劑可能需要6個月的準(zhǔn)備，導(dǎo)致向公眾發(fā)布疫苗批次的時間大大延遲，同時，SRID存在低精度和低通量的不足，并且一次檢測大約需要22小時。

SPR是一種更快速準(zhǔn)確的評估流感和其他疫苗效力的方法。

圖 17 在A、B和C通道的三次HA滴定注射以及控制通道D（藍色）的傳感器圖
 

圖 18 HA與抗HA抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)曲線

P4SPR可以通過固定抗HA抗體到芯片上，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測樣品中HA的數(shù)量。每個樣品只需10分鐘即可獲得數(shù)據(jù)。在疫苗生產(chǎn)過程中，安裝一個在線SPR儀器來實時評估疫苗批次將是有利的。