重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白在無血清細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

一、轉(zhuǎn)鐵蛋白簡(jiǎn)介

轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，TRF、TF）又稱運(yùn)鐵蛋白，是在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的生物液體中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白，主要由肝臟制造，轉(zhuǎn)鐵蛋白是體內(nèi)最關(guān)鍵的鐵池，它是身體鐵狀態(tài)的重要生化標(biāo)志物。轉(zhuǎn)鐵蛋白由位于同源N-端和C-端的兩個(gè)葉片（Lobe）組成的一種單鏈糖蛋白。人轉(zhuǎn)鐵蛋白共含678個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)為5.9、分子量為76kD。每分子的轉(zhuǎn)鐵蛋白能攜帶2個(gè)三價(jià)鐵離子(Fe³⁺)。轉(zhuǎn)鐵蛋白與Fe³⁺的相互作用取決于pH，pH為7.4時(shí)，轉(zhuǎn)鐵蛋白與Fe³⁺高效結(jié)合，在酸性pH下兩者分離。它一共有兩個(gè)鐵離子結(jié)合位，每個(gè)結(jié)合位可以與一個(gè)鐵離子結(jié)合。在羧基端（carboxyl terminal）的結(jié)合位與鐵離子有很高的親和力，只會(huì)與鐵離子結(jié)合。在氨基端的結(jié)合位則是可以與其他離子結(jié)合，親和力高低如下：鐵>鉻>錳>鎘>鎳。三價(jià)鐵離子與轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合需要一個(gè)陰離子的存在，通常是碳酸氫鹽。與鐵離子結(jié)合的轉(zhuǎn)鐵蛋白稱為飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白或全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（Holo-transferrin），未與鐵離子結(jié)合的轉(zhuǎn)鐵蛋白稱為脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（Apo-transferrin）。

轉(zhuǎn)鐵蛋白主要存在于血漿中，血漿中的轉(zhuǎn)鐵蛋白供應(yīng)機(jī)體絕大部分組織的鐵，而在其不能到達(dá)的部位，由這些組織自己合成的轉(zhuǎn)鐵蛋白在局部產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵作用，可自身合成轉(zhuǎn)鐵蛋白的其他組織和細(xì)胞還包括室管膜、少突膠質(zhì)細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系以及人乳腺癌細(xì)胞系[1]。轉(zhuǎn)鐵蛋白已在各種體液中檢測(cè)到，包括血漿、膽汁、羊水、腦脊液、淋巴和母乳。轉(zhuǎn)鐵蛋白的血漿濃度從出生起就穩(wěn)定，范圍為2g/L至3g/L，該蛋白的體內(nèi)半衰期為8天。轉(zhuǎn)鐵蛋白水平對(duì)于健康生長(zhǎng)非常重要，低于0.1g/L的水平與感染、生長(zhǎng)遲緩和貧血的發(fā)病率增加相關(guān)。

 
二、轉(zhuǎn)鐵蛋白重要的代謝角色

鐵是幾種代謝途徑和生理過程的重要元素[1]。鐵穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，因?yàn)樽兓瘯?huì)減少或過量對(duì)人體有害。鐵對(duì)所有生物都很重要。它在DNA復(fù)制中起著核心作用，其中一種關(guān)鍵酶是核糖核苷酸還原酶，需要鐵作為輔助因子。鐵還作為血紅素的輔助因子[2]。然而，游離鐵可能有毒，通過Fenton和Haber–Weiss反應(yīng)促進(jìn)自由基形成，從而導(dǎo)致組織氧化損傷。游離鐵通過將氫過氧化物轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性過氧基和烷氧基而引起脂質(zhì)過氧化[3]。此外，TF促進(jìn)涉及碳水化合物醛基和蛋白質(zhì)氨基的自氧化反應(yīng)，從而形成糖化產(chǎn)物。由于這些原因，鐵以氧化還原非活性形式運(yùn)輸是至關(guān)重要的。因此，TF的主要作用是將鐵安全地運(yùn)輸?shù)缴眢w周圍以供應(yīng)生長(zhǎng)細(xì)胞。

 
三、轉(zhuǎn)鐵蛋白的作用機(jī)理

轉(zhuǎn)鐵蛋白負(fù)責(zé)運(yùn)載由消化管吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵。以三價(jià)鐵復(fù)合物（TF-Fe³⁺）的形式進(jìn)入骨髓中，供成熟紅細(xì)胞的生成。轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）結(jié)合鐵是通過與其受體，即Transferrin Receptor 1(TFR1)相互作用而實(shí)現(xiàn)的。TFR1 是一種表達(dá)于細(xì)胞表面的糖蛋白，由兩個(gè)同源二聚體的亞基通過二硫鍵連接而成。在細(xì)胞表面，TF與Fe³⁺相互作用形成全鐵-TF，并與TFR1受體結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下進(jìn)入核內(nèi)體。在偏酸性核內(nèi)體的環(huán)境中，F(xiàn)e³⁺與TF分離，同時(shí)前列腺蛋白(STEAP)將Fe³⁺還原為Fe²⁺，并被二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（DMT1）轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，然后釋放了Fe³⁺的TF與TFR1組成TF/TFR1復(fù)合物，通過胞吐作用回游到細(xì)胞表面。在細(xì)胞表面，轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）與受體TFR1分離，成為脫鐵-TF，然后再與Fe³⁺重新結(jié)合參與鐵循環(huán)。整個(gè)過程完成后TF和TFR1被循環(huán)利用，進(jìn)入細(xì)胞攝取鐵的下一個(gè)周期中。
 

 

 
四、轉(zhuǎn)鐵蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中的重要作用

傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加胎牛或小牛血清組成。血清是一種含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需生長(zhǎng)因子的補(bǔ)充劑。而血清制品的定義不明確的性質(zhì)對(duì)于下游研究和治療應(yīng)用是不可取的，并且存在批次間差異。同時(shí)，血清可能含有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子和毒性因子，存在潛在毒性，血清的獲取成本高。血清由于成分不完全明確，給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化帶來困難，同時(shí)也給細(xì)胞表達(dá)目的產(chǎn)物純化等下游操作帶來困難。為了克服與血清相關(guān)的不一致性能，無血清培養(yǎng)基是絕對(duì)必要的。
 

細(xì)胞無血清培養(yǎng)基通常含有多種維生素、氨基酸、無機(jī)鹽、微量元素、激素、生長(zhǎng)因子以及結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，部分培養(yǎng)基包含動(dòng)物來源或微生物重組表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)。
 

轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)于確保足夠的細(xì)胞增殖和功能至關(guān)重要，對(duì)于絕大部分細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)是必需的，為絕大多數(shù)無血清培養(yǎng)基必需添加物組分，通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor, TFR) 相互作用，在無血清細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)揮重要功能。轉(zhuǎn)鐵蛋白能與三價(jià)鐵離子可逆性結(jié)合，調(diào)節(jié)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝，維持細(xì)胞內(nèi)的鐵以及鉻、錳、鎘、鎳等多種金屬離子的平衡穩(wěn)態(tài)�？删S持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，有類似于生長(zhǎng)因子的功能。而且，轉(zhuǎn)鐵蛋白也是一種重要的胞外抗氧化劑，可以避免細(xì)胞外環(huán)境中自由基的產(chǎn)生，防止細(xì)胞受到傷害。
 

總而言之，轉(zhuǎn)鐵蛋白是無血清培養(yǎng)體系中的重要成分，研究表明飽和鐵形態(tài)的轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)是最有效的形態(tài)。對(duì)于雜交瘤，黏連細(xì)胞和懸浮細(xì)胞系，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，應(yīng)保持培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度在0.5-100μg/ml。針對(duì)不同的細(xì)胞系，需要選擇最合適的濃度。

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參考文獻(xiàn)

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3. Rice-Evans C, Green E, Paganga G, Cooper C, Wrigglesworth J. Oxidised low density lipoproteins induce iron release from activated myoglobin. FEBS Lett 1993;326:177-182.

4. Devireddy LR, Myers M, Screven R, Liu Z, Boxer L. A serum-free medium formulation efficiently supports isolation and propagation of canine adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One 2019;14:e0210250.