活性氧 ROS 檢測實驗流程及其應(yīng)用
活性氧 (Reactive Oxygen Species，ROS) 是生物有氧代謝過程中的副產(chǎn)物，是一類含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱。ROS 的主要來源之一是線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈底物端。在有氧呼吸中，線粒體中的電子傳遞鏈復(fù)合物將電子傳遞給 O2，有一部分 O2 被還原，主要包括：超氧化物 (O2-)；過氧化氫 (H2O2)；單線態(tài)氧 (1O2)；羥基自由基 (HO.)；氫過氧自由基 (ROO.)；氧化物過氧亞硝基陰離子 (ONOO-) 等。
圖 1. ROS 對細胞的影響
圖 2. 受精后斑馬魚胚胎中內(nèi)源性 O2- 的共聚焦成像[1]
HKOCl 系列是以銠為基礎(chǔ)、特異性檢測 HOCl 的熒光探針。HKOCl-3 (HY-130025) 為綠色熒光探針，而 HKOCl-4 (HY-130027) 為黃色熒光探針，具有更長的吸收波長和更好的 pH 穩(wěn)定性。HKOCl-4m (HY-D1158) 特異靶向線粒體，可用于監(jiān)測線粒體內(nèi) HOCl。
圖 3. HKOCl-3 在多種細胞類型中檢測內(nèi)源性 HOCl[2]
ROS 染色實驗簡要流程 (以 HKOCl-3 為例 ）
HKOCl-3染色液配制
：
- 儲存液的配制
(注：HKOCl-3 儲存液建議分裝后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存)
- 工作液的配制
(注：請根據(jù)實際情況調(diào)整 HKOCl-3 工作液濃度，且現(xiàn)用現(xiàn)配)
- 細胞染色
貼壁細胞：棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化細胞。離心棄去上清后，加入 PBS 洗滌兩次，每次 5 分鐘。加入 1 mL HKOCl-3 工作液，室溫孵育 30 分鐘。400 g，4 ℃ 離心 3-4 分鐘，棄去上清。加入 PBS 洗滌細胞兩次，每次 5 分鐘。用 1 mL 無血清培養(yǎng)基或 PBS 重懸細胞后，使用熒光顯微鏡進行觀察。
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參考文獻
1. Jun Jacob Hu, et al. Fluorescent Probe HKSOX-1 for Imaging and Detection of Endogenous Superoxide in Live Cells and In Vivo. J Am Chem Soc. 2015 Jun 3;137(21):6837-43.
2. Hu JJ, Yang D, et al. HKOCl-3: a fluorescent hypochlorous acid probe for live-cell and in vivo imaging and quantitative application in flow cytometry and a 96-well microplate assay. Chem Sci. 2016 Mar 1;7(3):2094-2099.
