naica微滴芯片數(shù)字PCR在量化造血干細(xì)胞移植兒童巨細(xì)胞病毒感染的應(yīng)用

導(dǎo)讀

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家病毒病預(yù)防控制研究所和中國(guó)首都兒科研究所的科學(xué)家在Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology上發(fā)表了題為The Viral Load of Human Cytomegalovirus Infection in Children following Hematopoietic Stem Cell Transplant by Chip Digital PCR的文章。文中應(yīng)用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)建立了芯片數(shù)字PCR（cdPCR）方法，能夠精準(zhǔn)定量HSCT前后兒童HCMV感染的病毒載量。質(zhì)粒pUC57-UL83的cdPCR檢測(cè)限為103拷貝/ml，qPCR檢測(cè)限為297拷貝/ml。cdPCR檢測(cè)HCMV AD169毒株的結(jié)果為146拷貝/ml，表明cdPCR的靈敏度高于qPCR。

人類巨細(xì)胞病毒（HCMV）是一種普遍存在的β-皰疹病毒，已感染發(fā)展中國(guó)家高達(dá)90%的人口。作為一種常見病原體，HCMV感染在免疫抑制個(gè)體中引起了顯著的發(fā)病率和死亡率，特別是在接受了造血干細(xì)胞移植（HSCT）的患者中，原因是原發(fā)感染后潛伏感染的主要靶細(xì)胞是造血細(xì)胞。對(duì)于HSCT后的高危兒童，應(yīng)在出現(xiàn)臨床癥狀之前檢測(cè)HCMV感染，因?yàn)镠CMV病毒的載量及變化與HSCT兒童HCMV感染的發(fā)展和嚴(yán)重程度高度相關(guān)。因此，HCMV病毒載量的定量檢測(cè)對(duì)患兒的治療至關(guān)重要。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)開發(fā)了一種快速、直觀、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的檢測(cè)HSCT前后兒童HCMV病毒的絕對(duì)定量方法。

▶ 通過質(zhì)粒和培養(yǎng)毒株驗(yàn)證naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)靈敏度、特異性和重復(fù)性。

實(shí)驗(yàn)方法：

作者從首都兒科研究所兒童醫(yī)院收集了122名異體造血干細(xì)胞移植患兒、3名自體造血干細(xì)胞移植患兒樣本（男/女:73/52），中位年齡7.5歲。該研究通過質(zhì)粒和培養(yǎng)毒株驗(yàn)證naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)靈敏度、特異性和重復(fù)性均優(yōu)于qPCR。在HSCT前后，通過qPCR和cdPCR檢測(cè)所有供體和受體血清中的HCMV病毒載量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

作者通過含有pUC57-UL83基因的質(zhì)粒DNA分別評(píng)估cdPCR和qPCR的動(dòng)態(tài)范圍。cdPCR的檢測(cè)限 (LOD) 為103拷貝/ml (2.0拷貝/反應(yīng))，qPCR的LOD為297拷貝/ml。結(jié)果表明，cdPCR的靈敏度高于qPCR。

為了評(píng)估cdPCR數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，作者使用質(zhì)粒建立了HCMV DNA拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析cdPCR檢測(cè)的變異系數(shù)（CV、標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）。結(jié)果表明，cdPCR檢測(cè)具有良好的重復(fù)性（CV<15%）。稀釋質(zhì)粒的預(yù)期值與cdPCR檢測(cè)值之間也具有良好的一致性（cdPCR檢測(cè)值與稀釋質(zhì)粒的預(yù)期值R= 0.979, P< 0.05， qPCR檢測(cè)值與稀釋質(zhì)粒的預(yù)期值R= 0.939, P< 0.05）。

▲圖1 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估cdPCR檢測(cè)的HCMV DNA拷貝數(shù)的變化。黑線顯示質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同的散點(diǎn)是通過cdPCR測(cè)試到的HCMV DNA拷貝數(shù)。

作者又使用HCMV AD169毒株驗(yàn)證cdPCR的靈敏度。qPCR可以檢測(cè)到5.67×10 TCID50/ml HCMV DNA，但不能檢測(cè)到5.67 TCID50/ml HCMV DNA。cdPCR可以檢測(cè)5.67 TCID50/ml病毒的HCMV DNA。cdPCR的靈敏度優(yōu)于qPCR。

為了驗(yàn)證cdPCR方法的敏感性以及是否可以用于HSCT患者血液中的HCMV檢測(cè)，作者通過qPCR和cdPCR檢測(cè)了125例HSCT后兒童的全血樣本。在38份cdPCR陽(yáng)性樣本中，有4份qPCR陰性樣本。在91份qPCR陰性樣本中，有4份cdPCR陽(yáng)性。結(jié)果如表1所示。

HCMV在125個(gè)HSCT患兒的檢出率為30.40% (38/125)，HCMV病毒載量范圍為107拷貝/ml-6600拷貝/ml。男性組的檢出率為30.14% (22/73)，女性組的檢出率為30.77% (16/52)。在0-12歲HSCT后HCMV陽(yáng)性兒童中，HCMV的檢出率為89.47% (34/38)。在0-6歲組中，男性的檢出率為25.64% (10/39)，女性的檢出率為22.58% (7/31)。在7-12歲組中，男性的檢出率為39.29% (11/28)，女性的檢出率為40% (6/15)。12歲以上患兒HCMV檢出率為33.33% (4/12)，男性檢出率為16.67% (1/6)，女性檢出率為50% (3/6)。結(jié)果如表3所示。

綜上所述， cdPCR方法在HCMV檢測(cè)領(lǐng)域比qPCR更敏感，能快速、直觀、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的檢測(cè)HSCT患兒HCMV感染率及病毒載量。

原文鏈接：https://doi.org/10.1155/2022/2786841

參考文獻(xiàn)：

1.P. Griffiffiffiths, I. Baraniak, and M. Reeves, “,e pathogenesis of human cytomegalovirus,” Journal of Pathology, vol. 235, no. 2, pp. 288–297, 2015.

2.L. Dupont and M. B. Reeves, “Cytomegalovirus latency and reactivation: recent insights into an age old problem,” Reviews in Medical Virology, vol. 26, no. 2, pp. 75–89, 2016.

3.https://www.gene-pi.com/tutorials/

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。