OVOL2基因敲除小鼠助力探究OVOL2對(duì)乳腺癌有氧糖酵解轉(zhuǎn)錄的抑制作用

有氧糖酵解，又稱(chēng)為Warburg效應(yīng)，是癌癥的一種特征。即使在氧氣充足的情況下，癌細(xì)胞也會(huì)使用正常細(xì)胞僅在無(wú)氧條件下才會(huì)使用的糖酵解途徑。該過(guò)程在癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。盡管目前已對(duì)Warburg效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究，但對(duì)轉(zhuǎn)錄抑制的分子機(jī)制還知之甚少。

近日，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所葉棋濃研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，OVOL2在乳腺腫瘤中對(duì)有氧糖酵解發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Advanced Science》雜志上，有望為癌癥治療（特別是乳腺癌）提供一種新策略。

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了多種乳腺癌細(xì)胞系、OVOL2 KO細(xì)胞、OVOL2條件性基因敲除小鼠（由賽業(yè)生物使用TurboKnockout技術(shù)構(gòu)建）以及腫瘤標(biāo)本。他們采用熒光素酶分析和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析來(lái)研究OVOL2是否參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）和質(zhì)譜分析來(lái)鑒定OVOL2的互作組。之后，研究人員還通過(guò)多種分析測(cè)定了有氧糖酵解的表型，包括葡萄糖攝取、丙酮酸生成和乳酸生成。他們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中分析了細(xì)胞增殖和侵襲，并在裸鼠實(shí)驗(yàn)中分析了腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

技術(shù)路線
01 通過(guò)基因敲除確定OVOL2是糖酵解的關(guān)鍵抑制因子
02 確定OVOL2是否調(diào)節(jié)糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄及具體機(jī)制
03 確定OVOL2是否調(diào)節(jié)糖酵解表型以及癌細(xì)胞增殖和侵襲
04 深入剖析OVOL2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制
05 確定OVOL2表達(dá)和糖酵解與乳腺癌的臨床相關(guān)性

研究結(jié)果
1.OVOL2是糖酵解的關(guān)鍵抑制因子
癌細(xì)胞通過(guò)有氧糖酵解代謝葡萄糖，利用丙酮酸來(lái)產(chǎn)生乳酸。研究人員首先以MCF7乳腺癌細(xì)胞作為研究對(duì)象,鑒定低氧條件下與Warburg效應(yīng)抑制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。他們發(fā)現(xiàn)，OVOL2能夠顯著抑制葡萄糖攝取和乳酸生成。OVOL2是一種進(jìn)化上相當(dāng)保守的轉(zhuǎn)錄因子，它與胚胎發(fā)育的關(guān)系已經(jīng)被多項(xiàng)研究報(bào)道，也能抑制癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，但是否調(diào)控癌癥代謝，目前還不清楚。

之后，他們利用OVOL2 KO MCF7細(xì)胞系開(kāi)展分析，發(fā)現(xiàn)OVOL2調(diào)節(jié)了多個(gè)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)（圖1）。在OVOL2 KO MCF7細(xì)胞中，所有糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)均增強(qiáng)，而OVOL2的重新表達(dá)則拯救了基因敲除的影響。后續(xù)在OVOL2條件性基因敲除小鼠（由賽業(yè)生物提供）上開(kāi)展的研究也表明，OVOL2敲除后糖酵解基因表達(dá)增加。這些數(shù)據(jù)都強(qiáng)烈表明，OVOL2是糖酵解基因表達(dá)和糖酵解的關(guān)鍵抑制因子。
 

圖1 OVOL2抑制糖酵解基因表達(dá)和糖酵解^[1]

研究人員接下來(lái)通過(guò)熒光素酶分析和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析來(lái)確定OVOL2是否調(diào)節(jié)糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄。他們發(fā)現(xiàn)，OVOL2通過(guò)與糖酵解基因的啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)抑制其轉(zhuǎn)錄。為了深入剖析背后的機(jī)制，他們又通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）和質(zhì)譜分析來(lái)鑒定OVOL2的互作組。他們發(fā)現(xiàn)，OVOL2與NCoR和HDAC3形成共抑制復(fù)合物，其中NCoR作為橋梁因子參與了復(fù)合物的形成。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，OVOL2通過(guò)招募NCoR和HDAC3來(lái)抑制糖酵解基因的表達(dá)。

2.OVOL2通過(guò)有氧糖酵解調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移
既然OVOL2能夠抑制糖酵解基因的表達(dá)，那么它是否能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中的糖酵解表型？研究人員發(fā)現(xiàn)，OVOL2 KO增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的葡萄糖攝取、丙酮酸水平、乳酸產(chǎn)生以及ATP水平。OVOL2 KO細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞外酸化率（ECAR）增加以及氧氣消耗速率（OCR）降低。更重要的是，NCoR敲低消除了OVOL2調(diào)節(jié)這些作用的能力，表明OVOL2通過(guò)NCoR調(diào)節(jié)有氧糖酵解。

考慮到糖酵解在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，研究人員接下來(lái)分析了OVOL2是否通過(guò)NCoR來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖。OVOL2過(guò)表達(dá)降低了乳腺癌細(xì)胞的增殖，而NCoR敲低提高了它們的增殖。重要的是，NCoR敲低幾乎完全消除了OVOL2抑制癌細(xì)胞增殖的能力，表明OVOL2主要通過(guò)NCoR來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖。同樣，OVOL2也以NCoR依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)癌細(xì)胞侵襲。裸鼠上的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，OVOL2通過(guò)NCoR調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移（圖2）。
 

圖2 OVOL2通過(guò)有氧糖酵解調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移^[1]
 

在研究OVOL2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)癌蛋白MDM2（E3泛素連接酶）和抑癌蛋白p53蛋白參與其中。在乳腺癌細(xì)胞中，MDM2過(guò)表達(dá)和p53敲低都降低了OVOL2蛋白的表達(dá)，而蛋白酶體抑制劑MG132阻斷了這種作用。那么，MDM2和p53如何不同地調(diào)節(jié)OVOL2的表達(dá)？他們發(fā)現(xiàn)，p53通過(guò)MDM2調(diào)節(jié)OVOL2泛素化，而MDM2是OVOL2的E3泛素連接酶。后續(xù)的分析表明，p53通過(guò)與MDM2結(jié)合并抑制MDM2介導(dǎo)的OVOL2泛素化，從而激活OVOL2。

3.OVOL2表達(dá)在乳腺癌中的臨床意義
之前有報(bào)道稱(chēng)，OVOL2表達(dá)與人類(lèi)乳腺癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織相比，OVOL2在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。與OVOL2高表達(dá)的乳腺癌患者相比，OVOL2低表達(dá)患者的無(wú)病生存期和總生存期都較短。這表明OVOL2表達(dá)能夠很好地預(yù)測(cè)乳腺癌患者的預(yù)后。

研究結(jié)論

圖3 OVOL2在癌癥糖酵解及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用^[1]
 

在這項(xiàng)研究中，研究人員確定OVOL2是有氧糖酵解的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄抑制因子。OVOL2直接抑制幾個(gè)糖酵解關(guān)鍵基因的表達(dá)，而這些基因促進(jìn)了有氧糖酵解及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。利用癌細(xì)胞系、OVOL2敲除細(xì)胞系和OVOL2條件性基因敲除小鼠，他們發(fā)現(xiàn)OVOL2調(diào)節(jié)了糖酵解基因表達(dá)、葡萄糖攝取和乳酸生成。這些研究證明OVOL2是控制有氧糖酵解的主要轉(zhuǎn)錄因子，在糖酵解抑制中起因果作用（圖3）。靶向p53/MDM2/OVOL2軸為癌癥治療提供了一種潛在的途徑，特別是乳腺癌。

原文檢索：
[1]Zhang X, Luo F, Luo S, Li L, Ren X, Lin J, Liang Y, Ma C, Ding L, Zhang D, Ye T, Lin Y, Jin B, Gao S, Ye Q. Transcriptional Repression of Aerobic Glycolysis by OVOL2 in Breast Cancer. Adv Sci (Weinh). 2022 Sep;9(27):e2200705. doi: 10.1002/advs.202200705.

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Ovol2條件性 基因敲除小鼠

品系名稱(chēng)：
C57BL/6J-Ovol2^em1(flox)Cya

品系編號(hào)：
CKOCMP-107586-Ovol2-B6J-VA

產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-00584

應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、視力/眼睛、聽(tīng)力/耳

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