QCM技術(shù)在病毒-宿主（細(xì)胞）相互作用研究方面的應(yīng)用

一、QCM方法：

石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance，QCM）是一種非常靈敏的質(zhì)量檢測方法，其測量精度可達(dá)納克級別，比靈敏度在微克級的電子微天平高100 倍，理論上可以測到的質(zhì)量變化相當(dāng)于單分子層或原子層的幾分之一。石英晶體微天平利用了石英晶體諧振器的壓電特性，將石英晶振電極表面質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為石英晶體振蕩電路輸出電信號的頻率變化，進(jìn)而通過計算機(jī)等其他輔助設(shè)備獲得高精度的數(shù)據(jù)。

利用QCM技術(shù)，可以通過石英諧振器頻率的變化感知芯片表面質(zhì)量的變化，生成感應(yīng)曲線，其敏感度可達(dá)到分子水平。實驗時，只需將細(xì)胞、抗原或抗體等包被于芯片表面，將含有與之互作分子的溶液流過芯片表面，石英諧振器即可檢測分子間結(jié)合﹑解離等整個變化過程，生成一張傳感圖，提供動力學(xué)親和力等數(shù)據(jù)分析。

二、病毒與宿主研究方向的應(yīng)用：

1、病毒侵染細(xì)胞

《四聚體氨基酸基序特性在蛋白酶活化病毒載體功能研究中的作用》

T. M. Robinson, J. Judd, M. L. Ho. Role of Tetra Amino Acid Motif Properties on the Function of

Protease-Activatable Viral Vectors[J]. ACS Biomater Sci Eng. 2016 Nov; 2(11): 2026-2033.

四聚體氨基酸在 蛋白酶活化型病毒（PAVs） 表面形成“肽鎖”結(jié)構(gòu)，其作用是，在沒有蛋白酶存在的情況下，“肽鎖”鎖定，病毒不能與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合； 在MMP（基質(zhì)金屬蛋白酶）存在的情況下，“肽鎖”的四聚體基序被酶破壞，PAVs可定位于病理學(xué)位點區(qū)域的目標(biāo)細(xì)胞（該區(qū)域細(xì)胞具有升高的胞外蛋白酶特征），與細(xì)胞結(jié)合，將遺傳物質(zhì)核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，而將蛋白質(zhì)衣殼留在胞外（細(xì)胞膜上）。

研究者通過改變四聚體基序的特性，研究PAVs病毒載體與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合之間的關(guān)系，及其可能的機(jī)制。

在研究過程中，可以考慮采用以QCM技術(shù)為原理的儀器直接檢測病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合并導(dǎo)入核酸后在胞外（膜上）留下蛋白質(zhì)衣殼的過程，與常規(guī)的Western Blotting（蛋白免疫印跡法）和 銀染法相比，QCM技術(shù)具有更加簡便快捷和直觀的優(yōu)點。

2、與病毒誘導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物

《抑制Tip60可降低卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV)的裂解及其潛伏基因的表達(dá)并降低KSHV感染型腫瘤細(xì)胞的增殖》

Sydney Simpson, Guillaume Fiches, Maxime J. Jean. Inhibition of Tip60 Reduces Lytic and Latent Gene Expression of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpes Virus (KSHV) and Proliferation of KSHV-Infected Tumor Cells[J]. Front. Microbiol. 2018 Apr; 9:788.

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）是一種致瘤性病毒。對于免疫功能缺陷的個體，KSHV可誘發(fā)卡波氏肉瘤、原發(fā)型滲出性淋巴瘤（PEL）以及多中心型卡斯特曼病。

Tip60（一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，HAT）在此前的研究中已顯示出和KSHV潛伏期相關(guān)核抗原蛋白（LANA, 維持病毒潛伏狀態(tài)的主要因子）以及 ORF36（在裂解期表達(dá)的病毒激酶）具有相互作用。

研究者進(jìn)一步調(diào)查了Tip60-病毒相互作用的關(guān)系，以確定Tip60在病毒生命周期中的作用及其作為未來靶點治療的潛力。

通過在攜帶 含KSHV病毒附加體Bac36的質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中調(diào)節(jié)Tip60表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tip60對裂解復(fù)制以及潛在基因的有效表達(dá)都是至關(guān)重要的。Tip60的小分子抑制劑MG149和NU9056可類似地抑制潛伏和裂解基因，并且在野生型KSHV+/EBV-PEL，BCBL-1細(xì)胞中減少病毒產(chǎn)生。

在研究過程中，為了檢測藥物處理后細(xì)胞中Tip60以及相關(guān)蛋白的表達(dá)量，可以在對細(xì)胞收獲并裂解處理后，使用包被了相應(yīng)蛋白抗體的芯片、在利用QCM方法學(xué)的儀器上進(jìn)行檢測，使實驗過程更加簡便快捷。

3、抗原-抗體相互作用

《通過在平板表面固定綴合環(huán)肽以有效模擬HCV病毒包膜E2蛋白 作為 合成疫苗的策略》

Meuleman TJ, Dunlop JI, Owsianka AM. Immobilization by Surface Conjugation of Cyclic Peptides for Effective Mimicry of the HCV-Envelope E2 Protein as a Strategy toward Synthetic Vaccines[J]. Bioconjug Chem. 2018 Apr; 29(4):1091-1101.

使用基于肽的調(diào)節(jié)劑（即，抗原表位模擬物）對抗體-抗原相互作用的結(jié)合界面進(jìn)行模仿，具有應(yīng)用于疫苗設(shè)計的前景。

研究者采用配備了硫醇部分、可以用于支持環(huán)狀或線性多肽的柔性TEG接頭合成官能化的溴化物衍生物，環(huán)狀和線性表位模擬物通過馬來酰亞胺活化的平板表面上的游離硫醇部分共價綴合。

對具有共價、均一、定向包被表面的環(huán)狀或線性表位模擬物進(jìn)行ELISA實驗，用以探究肽環(huán)化過程對于模擬的HCV E2糖蛋白抗體-抗原相互作用的影響。實驗結(jié)果首次清楚地闡明環(huán)化肽優(yōu)于線性肽的性能，且環(huán)狀表位模擬物，而非線性表位模擬物，分別顯示出對其單克隆抗體HC84.1和V3.2的特異性。

上述用于構(gòu)建表位模擬物的策略通過簡單地改變合成肽內(nèi)的氨基酸序列顯示出其對于高通量篩選關(guān)鍵結(jié)合殘基的潛力。據(jù)此，438位的亮氨酸已被鑒定為結(jié)合單克隆抗體V3.2的關(guān)鍵結(jié)合殘基。

在研究過程中，可以考慮采用以QCM技術(shù)為原理的儀器進(jìn)行環(huán)狀或線性表位模擬物結(jié)合抗體的特異性檢測。與常規(guī)ELISA實驗相比，QCM技術(shù)可以獲得更多關(guān)于抗體-抗原相互作用的動力學(xué)信息以及靶標(biāo)識別的準(zhǔn)確度信息。

4、病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的體液免疫與細(xì)胞免疫（包括血清中的抗體“垂釣”）

《接種 輔助性T細(xì)胞 CD4位點封閉型 HIV-1 gp140包膜蛋白 疫苗的恒河猴具有強(qiáng)烈且持久的B細(xì)胞及ADCC免疫應(yīng)答特性》

Willy M. J. M. Bogers, Susan W. Barnett, Herman Oostermeijer. Increased, Durable B-Cell and ADCC Responses Associated with T-Helper Cell Responses to HIV-1 Envelope in Macaques Vaccinated with gp140 Occluded at the CD4 Receptor Binding Site[J]. J Virol. 2017 Sep; 91(19).

HIV-1 包膜蛋白gp140或gp120可引發(fā)較弱的B細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，因其持續(xù)時間較短，需要更好的策略來提高HIV-1包膜蛋白的免疫原性，以獲得更長久、更有效的HIV-1疫苗來誘導(dǎo)B細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

研究者假設(shè)病毒包膜蛋白與輔助性T細(xì)胞上的CD4受體結(jié)合導(dǎo)致了T細(xì)胞募集過程的失效，并因此缺乏強(qiáng)大、穩(wěn)健和持久的記憶B細(xì)胞來參與以后的免疫應(yīng)答過程。

為了驗證此假設(shè)，研究者通過采用與3-kDa CD4小蛋白模擬物形成穩(wěn)定交聯(lián)的方法來封閉gp140的CD4結(jié)合位點，其作用在于阻斷了gp140與CD4⁺輔助性T細(xì)胞的結(jié)合，同時保持了CD4的可誘導(dǎo)性，使ADCC（抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用）效應(yīng)器可以把經(jīng)過中和實驗（滅活）處理的抗原表位作為靶標(biāo)來啟動相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

研究者發(fā)現(xiàn)，與用gp140直接免疫處理的動物相比，接受CD4位點封閉疫苗處理的恒河猴能夠始終表現(xiàn)出優(yōu)越的B細(xì)胞應(yīng)答動力學(xué)以及優(yōu)越的ADCC特性。

對免疫反應(yīng)中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在抗原誘導(dǎo)期，CD4位點封閉組的輔助性T細(xì)胞分泌的抗原特異性白細(xì)胞介素4（IL-4）增加得更早（該過程采用酶聯(lián)免疫斑點法進(jìn)行檢測）。

所以，CD4位點封閉型gp140抗原可誘導(dǎo)優(yōu)越的B細(xì)胞和ADCC應(yīng)答，并且被增強(qiáng)的B細(xì)胞應(yīng)答被證明是非常持久的，在免疫作用后可持續(xù)超過60周。

在研究過程，QCM方法可以替代 B細(xì)胞酶聯(lián)斑點法實驗、ADCC實驗、T細(xì)胞酶聯(lián)斑點法實驗進(jìn)行多種抗原-抗體、抗體-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞的檢測（包括對細(xì)胞因子或特異性抗體進(jìn)行“垂釣”），可獲得關(guān)于免疫應(yīng)答過程的更詳細(xì)的時間、強(qiáng)度及動力學(xué)特性等數(shù)據(jù)。

       綜上，由于QCM技術(shù)的高靈敏性、檢出過程無需對分子進(jìn)行標(biāo)記、既可以進(jìn)行分子與分子，又可以進(jìn)行細(xì)胞與分子間相互作用的研究，且對于作用過程能夠提供詳細(xì)的動力學(xué)信息等優(yōu)點，目前已在細(xì)胞表面的動力學(xué)反應(yīng)、抗原抗體反應(yīng)、競爭力分析、配體垂釣、抗原表位定位等領(lǐng)域廣泛運用。在病毒-宿主（細(xì)胞）相互作用方面，可以考慮使用以QCM技術(shù)為原理的儀器替代或補(bǔ)充其他傳統(tǒng)研究手段，進(jìn)一步增強(qiáng)科研能力與效率。

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