Ampha Z32的應(yīng)用：花粉作為外源基因媒介的小麥遺傳轉(zhuǎn)化

瀏覽次數(shù)：1065　發(fā)布日期：2022-12-7　來源：澤泉

花粉使植物能夠通過異花受精轉(zhuǎn)移雄性配子，創(chuàng)造新的遺傳變異。受精、胚胎發(fā)生和種子發(fā)育的命運(yùn)取決于花粉維持其活力的能力，以便將封閉的配子傳遞給等待的胚珠。由于花粉容易獲取，且在將遺傳物質(zhì)傳遞給胚珠方面具有明確的作用，自19世紀(jì)以來，花粉一直被用作外源 DNA 的載體。花粉介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可以通過未成熟、發(fā)育中的花粉(稱為小孢子)或成熟的花粉粒來實(shí)現(xiàn)。利用成熟花粉粒的優(yōu)點(diǎn)是，轉(zhuǎn)染后的花粉粒有直接用于胚珠受精產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代的潛力；相比之下，小孢子的遺傳轉(zhuǎn)化則需要組織培養(yǎng)再生技術(shù)來產(chǎn)生雙單倍體轉(zhuǎn)基因植株�；诖耍藗冎饾u嘗試將花粉作為外來物質(zhì)的載體進(jìn)行不同作物的遺傳轉(zhuǎn)化的研究，如通過簡單的花粉照射和DNA-花粉的復(fù)合作用對玉米遺傳資源進(jìn)行基因改良，就能夠獲得高達(dá)9.29%的轉(zhuǎn)化效率；但遺憾的是，不論是使用根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化，還是花粉作為DNA載體，均未能在小麥（Triticum aestivum L.）成熟花粉介導(dǎo)的基因改良中取得令人滿意的轉(zhuǎn)化效率，這是由于小麥復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)及其對花藥/組織培養(yǎng)技術(shù)的高度基因型特異性反應(yīng)的限制。

通過質(zhì)�；駽RISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體轉(zhuǎn)染小麥花粉，如何在處理期間保持小麥花粉活力，是以花粉為基礎(chǔ)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化的難點(diǎn)。本文中悉尼大學(xué)Mehwish Kanwal等人研究了七個(gè)不同小麥基因型的花粉形態(tài)（大小、形狀和孔徑）及其在一系列萌發(fā)培養(yǎng)基中的活力，以評估利用花粉作為外源基因媒介進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化的可行性。

圖1 本研究所用方法總體示意圖

縮寫：a，花藥；f、花絲；lo，漿片；p、內(nèi)稃/內(nèi)穎；PGM，花粉萌發(fā)培養(yǎng)基；s、柱頭

掃描電鏡（SEM）對花粉形態(tài)的檢測結(jié)果表明，七種小麥基因型的花粉均為單孔型，結(jié)構(gòu)沒有顯著差異，但成熟花粉粒的大小和孔徑大小存在較大差異，其中小孔是花粉管萌發(fā)的位置，會(huì)促進(jìn)了各種生理過程，包括擴(kuò)散和內(nèi)吞作用，有助于吸收外源性材料，這可能會(huì)影響外源物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA、CRISPR RNPs)內(nèi)化到水合花粉中的能力。

表1 基于掃描電子顯微鏡（SEM）的七種小麥基因型的花粉形態(tài)

*在每個(gè)小麥基因型的30�；ǚ哿Ｉ嫌涗浟嘶ǚ蹣O軸長度（P）、花粉赤道軸長度（E）和孔徑的測量值。通過LSD檢驗(yàn)，在p=0.05時(shí)，列中的相同字母表示無顯著性差異。

圖2 掃描電鏡下的不同小麥基因型花粉粒

（A）單孔小麥花粉粒；（B） Gladius+Sr50花粉的赤道面觀，顯示5µm的表面孔徑；（C）Thatcher花粉赤道面觀，顯示4µm孔徑；（D） Lilian花粉的略斜極面觀，孔徑為3µm；（E）花粉在羽狀分枝柱頭表面萌發(fā)（用*表示）。

鑒于此前研究者所建立的小麥離體萌發(fā)培養(yǎng)基并不適用于本次研究中所使用的七種小麥基因型，Mehwish Kanwal等人在本次研究中對BK堿性萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行了一系列改良，結(jié)果表明小麥花粉在含有5%蔗糖、10%PEG4000、100mg/L硼酸、200mg/L硝酸鈣、100mg/L硝酸鉀和100mg/L硫酸鎂的pH=6.5培養(yǎng)基中，在20±2℃下水合5小時(shí)后可達(dá)到了最高的萌發(fā)率。與此同時(shí)，本研究還利用Ampha Z32花粉活力分析儀(IFC，瑞士Amphasys)對七種小麥基因型的花粉活力進(jìn)行同步檢測，結(jié)果表明IFC法與體外萌發(fā)法的結(jié)果之間具有強(qiáng)相關(guān)性(R2= 0.947)，IFC法明顯優(yōu)于IKI染色法。

圖3 幾種因素對Gladius+Sr50小麥品種萌發(fā)率（%）的影響

（a）不同pH值（LSD 0.05=8.49%）；（b）不同濃度的硼酸（mg/L）（LSD 0.05=6.81%）；（c）不同濃度的硝酸鈣（mg/L）（LSD 0.05=7.76%）。

圖4 體外萌發(fā)法（73.11±8.62%）與IFC法花粉活力（74.44±2.80%）檢測結(jié)果對比

在本次研究的受控條件下儲(chǔ)存小麥花粉，可有效延長其活力長達(dá)5小時(shí)，并能在優(yōu)化的培養(yǎng)基中成功發(fā)芽，這為進(jìn)一步研究花粉作為外源基因媒介進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯協(xié)議提供了重要的信息。

—— 原文 ——
Kanwal, M.; Gogoi, N.; Jones, B.; Bariana, H.; Bansal, U.; Ahmad, N. Pollen: A Potential Explant for Genetic Transformation in Wheat (Triticum aestivum L.). Agronomy 2022, 12, 2009.
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