naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在韓牛分子標(biāo)記物的準(zhǔn)確評(píng)估種質(zhì)的應(yīng)用

導(dǎo)讀

韓牛（Bos taurus coreanae）是一種馴化的哺乳動(dòng)物，在韓國消費(fèi)市場作為食物資源，其牛肉消費(fèi)量遠(yuǎn)超其他品種，這種消費(fèi)模式導(dǎo)致了區(qū)分韓牛和其他牛品種的分子研究的出現(xiàn)。不僅是牛，其他經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的不同品種在市場中的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也存在較大的差異，所以準(zhǔn)確進(jìn)行種質(zhì)鑒定勢在必行。

在之前的一項(xiàng)研究中，使用傳統(tǒng)的PCR方法和Sanger測序驗(yàn)證確定了由TE關(guān)聯(lián)缺失事件產(chǎn)生的韓牛特異性SV。它可以用作區(qū)分不同牛品種的分子標(biāo)記（即韓牛與荷斯坦牛）。然而，PCR存在缺陷，每個(gè)樣品都有各種最終拷貝定量。為了克服傳統(tǒng)PCR的局限性，并準(zhǔn)確評(píng)估先前研究中確定的韓牛特異性SV位點(diǎn)，檀國大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系聯(lián)合畜牧研究所和檀國大學(xué)醫(yī)學(xué)院，使用naica️®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)韓牛特異性SV位點(diǎn)進(jìn)行了更為精確的檢測，并將成果《Quantitative evaluation of the molecular marker using droplet digital PCR》發(fā)表在Genomics & Informatics雜志上。

轉(zhuǎn)座元件（TEs）約占�；�因組的一半。它們可以是一個(gè)強(qiáng)大的物種特異性標(biāo)記，在基因組進(jìn)化時(shí)沒有結(jié)構(gòu)變異（SV）的回歸突變。因此，作者應(yīng)用naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)韓牛特異性SV進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測。雖然樣品在韓牛群體中的等位基因頻率變化較低，但naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)可以通過絕對(duì)定量進(jìn)行高靈敏度檢測，可以做到比PCR更準(zhǔn)確的定量。所以naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)平臺(tái)相比于傳統(tǒng)PCR更適用于分子標(biāo)志物的定量評(píng)價(jià)。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)韓牛特異性SV進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測。

▶ dPCR測定在計(jì)數(shù)單分子和分析特定群體的少量拷貝時(shí)可以高精度地定量，與qPCR相比，具有更高的準(zhǔn)確性。

▶ 經(jīng)過sanger測序，確定了naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測準(zhǔn)確無誤，且操作和成本均低于測序。

▶ naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)適用于分子標(biāo)志物的定量評(píng)價(jià)。

實(shí)驗(yàn)方法：

檢測樣本信息：

共提取了五個(gè)棕色韓牛DNA和五個(gè)荷斯坦DNA作為實(shí)驗(yàn)樣本。

檢測方法：

為了更準(zhǔn)確地檢測韓牛特異性SV，將“Del_96”位點(diǎn)應(yīng)用于naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)（Stilla Technologies）。進(jìn)行naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)前確認(rèn)韓牛和荷斯坦牛的DNA的濃度定量。FAM引物組和FAM探針用于檢測韓牛和荷斯坦牛基因組。VIC引物組和VIC探針設(shè)計(jì)在韓牛特異性缺失（圖 1B)。因此，F(xiàn)AM引物組和FAM探針（陽性對(duì)照）設(shè)計(jì)在所有牛DNA中檢測。VIC引物組和VIC探針設(shè)計(jì)用于僅檢測韓牛的熒光。

▲圖 1B

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

FAM染料在所有�；�因組中均被檢測到，VIC染料僅在韓牛樣品中顯示出顯著的檢測。這表明所有韓牛基因組都包含特定的缺失序列（Del_96區(qū)域）。在韓牛樣品中檢測到VIC染料的信號(hào)平均濃度為243（copies/ μL）。雖然在荷斯坦樣品中也檢測到平均濃度0.12（copies/μL）的VIC染料信號(hào)，但這些信號(hào)相比韓牛可忽略不計(jì)。

▲naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測韓Del_96和荷斯坦樣品之間區(qū)域的絕對(duì)拷貝數(shù)比較。濃度圖在 X 軸上指示樣品數(shù)，在 Y 軸上指示對(duì)數(shù)刻度條（拷貝/μL）。（A）在所有樣品中檢測到FAM熒光。韓牛樣品的絕對(duì)拷貝數(shù)大約是荷斯坦樣品的兩倍。（B）僅在韓牛樣品中強(qiáng)烈檢測到VIC熒光。

最后，文章Results and Discussion給出-數(shù)字PCR適合作為驗(yàn)證物種特異性標(biāo)記的平臺(tái)。

綜上，對(duì)于naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，準(zhǔn)確定量絕對(duì)拷貝數(shù)是一個(gè)關(guān)鍵特征，相比qPCR準(zhǔn)確性更高，naica^®微滴芯片數(shù)字PCR為本文的檢測提供了有利的支持，也驗(yàn)證了這一特征。在不久的將來，通過將物種識(shí)別工具應(yīng)用于naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，它作為大樣本量物種鑒定平臺(tái)具有巨大潛力。所以naica️^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)適合作為驗(yàn)證物種特異性標(biāo)記的平臺(tái)。

原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7120350/

期刊介紹：

Genomics & Informatics是由韓國基因組組織發(fā)行的涉及農(nóng)業(yè)和生物科學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、健康信息學(xué)等領(lǐng)域的期刊。