Protein Maker高通量全自動(dòng)蛋白純化儀的應(yīng)用案例
Protein MakerTM高通量全自動(dòng)蛋白純化儀可以通過平行純化加速您的蛋白功能研究。它具有24個(gè)平行純化柱（1-5 ml），并且可以全自動(dòng)處理96個(gè)樣本， Protein MakerTM主要具有的三大操作模式（生產(chǎn)模式、偵測(cè)模式、復(fù)合模式）以靈活的設(shè)計(jì)使其可以適用于多個(gè)應(yīng)用場景。接下來，讓我們一起來了解一下吧。
1 生產(chǎn)模式
1.1 抗體生產(chǎn)或篩選——工程抗體的純化
Had是針對(duì)病毒抗原靶標(biāo)的完全人源化抗體，對(duì)野生型靶標(biāo)具有高親和力，而對(duì)流行的自然變異株不具有親和力；實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是提高該抗體對(duì)變異株的親和力而不喪失對(duì)野生型靶標(biāo)的親和力。實(shí)驗(yàn)使用1ML的HiTtrap蛋白A柱對(duì)24個(gè)突變體（在CHO細(xì)胞中表達(dá)）各純化50 ml。產(chǎn)量為2-10 mg，純化結(jié)果可以為生物物理特性分析（例如SEC/LS、 SDS-PAGE和DSC等分析）以及親和力測(cè)定提供足夠的材料。
圖 1 突變體13-24的非還原性和還原性SDS-PAGE結(jié)果
圖 2 突變體1、22和24的SCE液相色譜分析結(jié)果圖
1.2 多個(gè)結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)和純化
1.2.1 多結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和純化
Protein MakerTM高通量全自動(dòng)蛋白純化儀平行處理可實(shí)現(xiàn)多個(gè)構(gòu)建體（內(nèi)部缺失突變體）的規(guī)�；兓⑶耀@得具有可以高度結(jié)晶化的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)利用大腸桿菌優(yōu)化表達(dá)基因，表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)到每升細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)0.1-15 mg。
圖 3 分別加裂解液和洗脫液的電泳結(jié)果
圖 4 結(jié)晶化電鏡圖
1.2.2 激酶X-17構(gòu)建體的生產(chǎn)
圖 5 平行鎳柱親和純化（4次洗脫）
圖 6 9個(gè)結(jié)構(gòu)去除His標(biāo)簽，并用于晶體篩選
1.3 不同裂解液平行測(cè)試
細(xì)胞色素P450（CYP51A1）不溶于標(biāo)準(zhǔn)裂解緩沖液，通過改變裂解緩沖液條件使其可溶，Protein MakerTM除了是高通量純化的有效手段，還可以是快速測(cè)試多種蛋白質(zhì)靶細(xì)胞裂解條件的寶貴工具，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了12種不同的裂解緩沖液條件，探索細(xì)胞色素P450作為靶細(xì)胞可溶的特定條件。
表格 1 細(xì)胞色素P450的細(xì)胞裂解緩沖液測(cè)試條件表
圖 7 CYP51A1的12種不同細(xì)胞裂解緩沖液條件下的SDS-PAGE分析。紅框帶表示親和層析后兩種產(chǎn)生最佳產(chǎn)率的細(xì)胞裂解液條件下的檢測(cè)結(jié)果。
1.4 通過并行化實(shí)現(xiàn)無風(fēng)險(xiǎn)規(guī)�；�
6×5 ml柱床平行純化，利用Protein MakerTM無需傳統(tǒng)的放大純化步驟，只需四步可以將目標(biāo)蛋白從20 mg純化到遠(yuǎn)大于100 mg，可以通過開發(fā)5×放大方案，重復(fù)5-6×初始純化或者平行做各種模式小規(guī)模純化。
圖 8 四步層析結(jié)果圖：①Ni-親和層析；②融合蛋白分離；③2ndNi-親和層析；④大小排除層析
2 偵測(cè)模式——不同樹脂平行測(cè)試
偵測(cè)不同的樹脂（最多24個(gè)）以優(yōu)化一種蛋白質(zhì)。
圖 9 利用不同樹脂的層析結(jié)果圖
3 復(fù)合模式
3.1 多柱純化
圖 10 自動(dòng)雙柱純化圖
3.2 兩步純化
利用Ni柱和Protein A柱對(duì)Fab進(jìn)行2步純化。Ni純化的His-tagged Fabs需要額外做純化，尤其是對(duì)低產(chǎn)率蛋白，2步純化普遍產(chǎn)率較高，Ni純化后需要利用緩沖液進(jìn)行交換，而Protein A被串聯(lián)添加后可以提高純度并且不需要再進(jìn)行緩沖液的交換。
圖 11 不同條件下電泳結(jié)果圖：①通道表示無細(xì)胞提取物；②通道表示Ni純化；③通道表示Ni和Protein A純化
Protein MakerTM除了具有以上這些場景的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)外，配置的軟件系統(tǒng)也非常方便快捷，可定制化純化方案，并且提供實(shí)時(shí)的純化狀態(tài)信息，您可以通過軟件隨時(shí)暫停任何過程，純化結(jié)束，軟件還可以幫助分析和共享結(jié)果。結(jié)合以上優(yōu)點(diǎn)，相信，Protein MakerTM一定可以助力您的蛋白純化相關(guān)研究。
