小鼠基礎(chǔ)知識(shí)八：Tamoxifen誘導(dǎo)型cre

Cre-lox系統(tǒng)雖然能有效幫助我們?cè)谔囟ǖ慕M織中進(jìn)行基因敲除，但Cre重組酶表達(dá)的時(shí)間是由其啟動(dòng)子決定的。如果你希望在特定時(shí)間段人為操縱Cre重組酶的活性，比如說(shuō)要研究某個(gè)基因在小鼠發(fā)育特定時(shí)期的功能，應(yīng)該怎么辦呢？今天J博士將介紹一種時(shí)空特異性敲除系統(tǒng)：Tamoxifen誘導(dǎo)型CreER重組酶。

01 什么是CreER重組酶

為了給Cre-Lox系統(tǒng)的加上可誘導(dǎo)的屬性，研究者開(kāi)發(fā)了配體依賴的CreER重組酶。

它由cre重組酶與雌激素受體(estrogen receptor, ER)的激素結(jié)合域相融合組成。在沒(méi)有雌激素類似物Tamoxifen的作用下，CreER重組酶停留在細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)法發(fā)揮功能；只有在與雌激素結(jié)合的條件下，CreER才可以進(jìn)入細(xì)胞核中驅(qū)動(dòng)LoxP位點(diǎn)發(fā)生重組。目前為止，CreER系統(tǒng)已經(jīng)改進(jìn)成雌激素結(jié)合域攜帶G400V/M543A/L544A三位點(diǎn)突變的CreERT2重組酶系統(tǒng)，其在無(wú)誘導(dǎo)物的情況下降低了本底活性，并同時(shí)提高了Tamoxifen的敏感性和效率。

02  Tamoxifen的配制和使用劑量

如何配制和使用Tamoxifen，是CreER系統(tǒng)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)中不可避免會(huì)遇到的問(wèn)題。針對(duì)這一點(diǎn)，J博士總結(jié)了一些常用的方法供大家參考。

需要注意的是，不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、不同的小鼠品系以及不同的分析方法對(duì)于前期實(shí)驗(yàn)的要求往往有所差異，包括給藥劑量、給藥頻率和方式等。因此，下述方法只是一個(gè)參考，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中往往還應(yīng)根據(jù)參考文獻(xiàn)、實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定最佳方案。

▲ Tamoxifen的配制

將Tamoxifen溶解在玉米油中，終濃度為20 mg/ml，并在37 ℃下?lián)u晃過(guò)夜。需注意Tamoxifen對(duì)光敏感，在制備和儲(chǔ)存過(guò)程中需要避光處理。Tamoxifen溶解后可短暫保存于4 ℃，長(zhǎng)期保存需存放在-20 ℃。

▲ Tamoxifen使用劑量

Tamoxifen可以通過(guò)腹腔注射、灌胃、飲食/飲水等方式進(jìn)行給藥，不同的方法所需要注意的點(diǎn)不盡相同。

① 腹腔注射給藥

● 優(yōu)：劑量精準(zhǔn)

● 缺：對(duì)小鼠壓力大，需要熟練操作

成年鼠誘導(dǎo)時(shí)需按體重確定注射劑量，約75 mg/kg小鼠體重。每24小時(shí)注射一次，連續(xù)2~5天，在最后一次注射結(jié)束后7天便可開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

● 對(duì)于需要胚胎期誘導(dǎo)的小鼠，可以對(duì)孕鼠按上述劑量進(jìn)行1~2天Tamoxifen腹腔注射。但是需注意Tamoxifen會(huì)影響胎兒發(fā)育和生產(chǎn)，誘導(dǎo)的時(shí)間盡量選擇孕晚期，并同時(shí)注射孕酮來(lái)減少流產(chǎn)概率。

● 除以上建議的劑量以外，J博士還整理了部分文獻(xiàn)中對(duì)孕鼠和新生小鼠給藥方式^[1]，供大家參考使用：

② 灌胃給藥

● 優(yōu)：較飲食/飲水而言劑量準(zhǔn)確，較腹腔注射而言對(duì)小鼠壓力小

● 缺：操作耗費(fèi)時(shí)間，同樣需要熟練操作

● 同樣需要按體重給藥，約75 mg/kg小鼠體重，每24小時(shí)灌胃一次，連續(xù)5天。

③ 飲食/飲水給藥

● 優(yōu)：對(duì)小鼠造成壓力最小

● 缺：易受小鼠飲食習(xí)慣影響，且在水中溶解度低，誘導(dǎo)時(shí)間需較長(zhǎng)

● 與腹腔注射和灌胃相比，飲食/飲水需要長(zhǎng)達(dá)幾周的誘導(dǎo)時(shí)間，在此期間體重也可能會(huì)比正常水平下降10%~15%。

注意事項(xiàng)

● Tamoxifen不溶于水，需溶于酒精和玉米油中。

● 對(duì)照組小鼠需要同步進(jìn)行不含Tamoxifen的玉米油溶液給藥。

● Tamoxifen處理組和未處理小鼠應(yīng)該分籠飼養(yǎng)，舐舔Tamoxifen懸浮液、梳毛或吞食行為可能會(huì)導(dǎo)致Tamoxifen意外攝入并誘導(dǎo)敲除。