小鼠基礎知識九：認識四環(huán)素誘導型Cre-lox系統
在上一講中，J博士介紹了依賴tamoxifen誘導型CreER重組酶系統，它能夠幫助我們實現空間與時間雙重特異性調控基因的目的。
內容回顧：小鼠基礎知識八｜J博士進階教學，Tamoxifen誘導型cre
今天，J博士帶領大家學習另外一種可逆的四環(huán)素誘導型Cre-lox系統，又可被稱為Tet on/off系統。
本篇內容重點：
● 什么是Tet on/off 系統
● 小鼠中如何應用Tet on/off系統
● Tet on/off誘導系統優(yōu)點和常用品系
● Dox給藥方式
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01
什么是Tet on/off系統
四環(huán)素（Tetracycline,Tet）誘導系統是由E.coli大腸桿菌中Tn10轉座子改造而來，可依賴四環(huán)素進行可逆地調控基因表達。
如下圖所示，該系統在大腸桿菌中由四環(huán)素阻遏蛋白（Tet repressor, TetR）和Tet操縱子（Tet operator, TetO）組成。
● 在缺乏四環(huán)素(Tc)或其衍生物強力霉素（dox）的情況下，TetR二聚體與TetO結合，阻斷基因表達（左圖）。
● 當Tc或dox與TetR結合時，誘導TetR構象變化，導致其與TetO分離并促進基因表達（右圖）。
四環(huán)素調控系統原理[1]
利用TetR阻遏蛋白和TetO DNA元件可以在依賴Dox作用下進行可逆結合的原理，研究者開發(fā)出適用于真核生物的調控系統。將TetR與單純皰疹病毒（HSV）VP16蛋白轉錄激活區(qū)域融合使其起到增強子的功能。并將TetO改造為弱啟動子，只有與TetR增強子相結合才可調控下游基因表達的正常表達。
如下圖所示：TetR被改造為存在Dox的情況下，分別起到結合或不接合TetO兩種效果，即Tet on/off系統。
● Tet on系統中，tetR被改為rtTA，在Dox存在條件下，可以與tetO結合開啟下游基因表達，因此為Tet on系統；
● Tet off系統中，tetR被改造為tTA，其與Dox結合后從TetO元件上解離下來，關閉基因表達，因此為Tet off系統。
02 小鼠中如何應用Tet on/off系統
以Tet on為例，在小鼠中通常將rtTA元件和tetO元件分別構建在不同的小鼠品系當中，而rtTA可以在不同的啟動子下驅動，以達到特異性組織誘導的功能。兩個小鼠品系配繁的后代，即可通過Dox給藥或去藥，達到在特異組織中可逆調控基因表達的目的。
此外，Tet on/off系統還可以與cre-lox系統聯合使用，利用強大的cre工具小鼠庫，不需要重新構建rtTA/tTA小鼠即可實現在廣泛的組織中進行可逆調控基因表達。
比如：我們先利用Pdx1-cre小鼠和帶有LSL元件的rtTA floxed小鼠配繁，使其后代在胰腺表達rtTA蛋白。再將這個小鼠與攜帶tetO元件的Kras*G12D小鼠配繁，其后代小鼠就可以在Dox誘導下調控Kras*G12D蛋白的表達了。
03 Tet on/off誘導系統優(yōu)點和常見品系
● 精準性：藥物劑量及誘導時間可控，無內源干擾
● 可逆性：去除Dox后系統即關閉，并可反復多次誘導
● 靈敏性：低劑量，即可獲得高效率結果
● 便捷性：使用食物或飲水給藥，即可取得良好效果
04 Dox給藥方式
● 飲水 ：用水制成100倍的Dox 20 mg/mL的儲備溶液。在小鼠設施中，配置成最終濃度為200微克/毫升的溶液。最好使用琥珀色的水瓶，因為Dox對光敏感。
● 飲食：食物中的Dox可由飼料公司進行定制，每kg飼料中加入200 mg Dox。在食物中可以添加食用色素，有助于追蹤哪些小鼠在服用DOX。
● 腹腔注射：10 mg Dox在0.5mL水中可以作為一次IP注射，僅針對病重的小鼠(如無法自主飲食的小鼠)。
需要注意的是，不同基因工程小鼠對于Dox的響應是有區(qū)別的，最好還是參考所關心的小鼠品系的相關文獻，并且在開展自己的實驗前，根據實驗目的進行條件摸索。
參考文獻：
[1] van Til NP, Markusic DM, van der Rijt R, Kunne C, Hiralall JK, Vreeling H, Frederiks WM, Oude-Elferink RP, Seppen J. Kupffer cells and not liver sinusoidal endothelial cells prevent lentiviral transduction of hepatocytes. Mol Ther. 2005 Jan;11(1):26-34.
