naica微滴芯片數(shù)字PCR在基因編輯脫靶檢測的應(yīng)用

導(dǎo)讀

漢堡-埃彭多夫大學(xué)醫(yī)學(xué)中心（UKE）的研究者在Molecular Therapy: Methods & Clinical Development上發(fā)表了題為LATE–a novel sensitive cell-based assay　for the study of CRISPR/Cas9-related　long-term adverse treatment effects的文章。

文中應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)開發(fā)了一種長期不良治療效應(yīng)（LATE）體外檢測方法評估促生長脫靶事件的風(fēng)險(xiǎn)，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化事件來評估Cas9蛋白的潛在毒性。在小規(guī)模原理驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，可重復(fù)地檢測到由TP53基因脫靶切割引起的原代人新生兒包皮成纖維細(xì)胞（NUFF細(xì)胞）中低頻的（<0.5%）促生長事件。作者還比較了不同Cas9蛋白的脫靶毒性，證明現(xiàn)有的高保真核酸酶比第一代Cas9脫靶概率大幅降低。在這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究中，LATE檢測可以評估CRISPR/Cas9系統(tǒng)的生理學(xué)不良反應(yīng)，有利于臨床前安全性研究。

自CRISPR / Cas9技術(shù)問世以來，基因編輯已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用生物學(xué)領(lǐng)域，將其轉(zhuǎn)化為臨床試驗(yàn)則引起了安全性問題。盡管脫靶事件的頻率和位置已被廣泛研究，但人們對它們在大規(guī)模、長期的應(yīng)用環(huán)境中潛在的生物學(xué)后果知之甚少。所以開發(fā)一種操作性強(qiáng)的體外檢測方法來評估這一問題則至關(guān)重要。

由于脫靶相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)非常明顯，這不僅促成了各種算法的建立來預(yù)測靶位點(diǎn)脫靶突變的可能性，而且還建立了幾種無偏、通用的技術(shù)來分析全基因組的雙鍵斷裂（DSB）。但現(xiàn)有的主流方法都依賴于某種形式的高通量測序來檢測靶位點(diǎn)或全基因組范圍內(nèi)的突變。而二代測序（NGS）是一種相當(dāng)昂貴的方法，也需要先進(jìn)的生物信息學(xué)技術(shù)來進(jìn)行詳細(xì)的數(shù)據(jù)分析。此外，上述所有算法和方法僅能提供脫靶的位置和頻率信息，而它們對細(xì)胞生理學(xué)的潛在后果仍是未知。目前也缺乏對設(shè)計(jì)核酸酶Cas9蛋白潛在長期不良影響的評估方法。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)構(gòu)建了GEF-dPCR（基因編輯頻率數(shù)字PCR）檢測方法。

▶ dPCR在檢測低頻突變時(shí)比NGS具有更高靈敏度和準(zhǔn)確性。

▶ GEF-dPCR可以和NGS互相驗(yàn)證，GEF-dPCR可能比NGS更不容易受到單核苷酸缺失或交換的影響。

實(shí)驗(yàn)方法：

之前有研究表明NUFF細(xì)胞敲除TP53會(huì)導(dǎo)致相對生長優(yōu)勢，作者根據(jù)這種已經(jīng)確立的生長優(yōu)勢設(shè)計(jì)了圖1所示的LATE檢測流程。LATE檢測的步驟如下：

１、通過編碼eGFP、 Cas9和gRNA的一體化慢病毒載體LeGO-CC轉(zhuǎn)導(dǎo)NUFF細(xì)胞；

２、轉(zhuǎn)導(dǎo)8-10周后每周通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；

３、通過定量轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞生長優(yōu)勢指標(biāo)來判斷基因組編輯的影響，陽性結(jié)果中熒光細(xì)胞占絕對優(yōu)勢，陰性結(jié)果中熒光細(xì)胞不存在生長優(yōu)勢。

▲圖１.　LATE檢測原理圖

為了確定LATE檢測是否也可用于評估由非預(yù)期脫靶TP53敲除引起的生長優(yōu)勢，作者篩選了５個(gè)靶向其他基因但與TP53具有一定相似性的gRNA，它們含有1到3個(gè)與TP53編碼序列的錯(cuò)配。如表1所示，CYP1A1/2、GFOD、OBSL和RFX gRNA會(huì)有一定概率靶向TP53，引起NUFF細(xì)胞的生長優(yōu)勢。

表1.研究使用的gRNA列表及其與TP53外顯子4序列的比對

LATE檢測中的陽性結(jié)果理論上也可能是由非預(yù)期脫靶TP53敲除以外的原因（如插入突變）引起的。為了研究LATE檢測的陽性結(jié)果和（從頭產(chǎn)生的）TP53插入/缺失（indel）之間的聯(lián)系，作者使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)設(shè)計(jì)了一種新型的GEF-dPCR技術(shù)，又被稱為drop-off檢測。該方法使用兩個(gè)雙標(biāo)記的水解探針，可用于定量Cas9介導(dǎo)的DSB修復(fù)期間由非同源末端連接（NHEJ）引起的gRNA結(jié)合位點(diǎn)的indel頻率。HEX標(biāo)記的探針結(jié)合區(qū)域遠(yuǎn)離gRNA識(shí)別序列，因此其結(jié)合不受DNA修復(fù)過程影響。FAM標(biāo)記drop-off探針的結(jié)合會(huì)被NHEJ產(chǎn)生的indel影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

作者應(yīng)用GEF-dPCR來量化編碼Cas9和CYP1A1、OBSL和RFX gRNA的LeGO CC載體轉(zhuǎn)導(dǎo)NUFF細(xì)胞中脫靶至TP53引入的indel頻率。他們使用了相同的PCR引物和HEX標(biāo)記的探針，并設(shè)計(jì)了FAM標(biāo)記的靶標(biāo)特異性drop-off探針（圖3A）。結(jié)果顯示三種gRNA的陽性LATE檢測結(jié)果確實(shí)與TP53 indel的增加相關(guān)（圖3C）。值得注意的是，在轉(zhuǎn)導(dǎo)OBSL gRNA的情況下，可檢測到的TP53 indel頻率低至0.2%（圖3C），這種低頻的脫靶效應(yīng)可以通過LATE檢測來定量，并且在所有對照樣本中沒有檢測到類似的TP53外顯子4 突變和indel。這一觀察凸顯了LATE檢測在發(fā)現(xiàn)罕見的促生長事件方面的敏感性，比NGS具有更高靈敏度和準(zhǔn)確性。

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▲圖3 NUFF細(xì)胞獲得的生長優(yōu)勢與TP53中的indel頻率相關(guān)。（A）用于GEF-dPCR的TP53外顯子4和互補(bǔ)的FAM和HEX標(biāo)記探針片段如圖所示。FAM標(biāo)記的探針結(jié)合gRNA靶向Cas9的位置，因此當(dāng)TP53序列的互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)沒有indel時(shí)能夠結(jié)合。HEX標(biāo)記探針結(jié)合Cas9切割位點(diǎn)外的TP53序列。（B）在指定時(shí)間點(diǎn)從NUFF細(xì)胞中獲得基因組DNA樣品，這些細(xì)胞在三個(gè)不同的MOI下轉(zhuǎn)導(dǎo)了編碼eGFP，Cas9和靶向TP53 gRNA（LeGO-CC-p53）的一體化慢病毒顆粒（LeGO-CC-p53）。通過GEF-dPCR定量一段時(shí)間內(nèi)靶向TP53外顯子4的indel頻率。（C）在指定的時(shí)間點(diǎn)從NUFF細(xì)胞中獲得基因組DNA樣品，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)了編碼靶向Cas9及CYP1A1，OBSL1或RFX1的gRNA一體化慢病毒顆粒。通過GEF-dPCR定量一段時(shí)間內(nèi)非預(yù)期脫靶TP53外顯子4敲除的indel頻率。（D）用LeGO-CC-p53治療后第7天和第53天對TP53外顯子4進(jìn)行深度測序得到的indel長度及頻率。

為了增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向特異性，Cas9核酸酶一直是優(yōu)化的重點(diǎn)。科學(xué)家對SpCas9一直在進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的修改以及隨機(jī)誘變。有研究表明正電荷殘基（K855A）的單個(gè)丙氨酸取代可以降低Cas9脫靶活性。作者通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向TP53分析SpCas9 K855A的核酸酶特異性。如圖6A所示，在實(shí)驗(yàn)前10天，經(jīng)SpCas9 K855A和wt Cas9處理細(xì)胞的eGFP陽性細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)接近，但隨著時(shí)間的推移SpCas9 K855A處理的eGFP陽性細(xì)胞數(shù)量更多。作者通過GEF-dPCR和深度擴(kuò)增子測序這兩種技術(shù)都證實(shí)，隨著時(shí)間的推移TP53中攜帶indel的細(xì)胞數(shù)量不斷增加。GEF-dPCR檢測到轉(zhuǎn)導(dǎo)52天后最高插入indel頻率為65%（圖6B），在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第55天約80%的NGS讀數(shù)檢測到indel。有趣的是當(dāng)SpCas9 K855A與CYP1A1（非靶向TP53）gRNA一起使用時(shí)，與用相同gRNA和wt Cas9處理的NUFF細(xì)胞相比，eGFP陽性細(xì)胞的比例生長慢得多（圖6A），這應(yīng)該與SpCas 9 K855A特異性的提高有關(guān)。

在第二組實(shí)驗(yàn)中，作者對eSpCas9 1.0（特異性優(yōu)于SpCas 9 K855A）進(jìn)行了上述相同的分析，在LATE試驗(yàn)中沒有觀察到CYP1A1 gRNA脫靶TP53的eGFP陽性細(xì)胞的生長，而靶向TP53的ｇＲＮＡ與wt Cas9一樣有效（圖6A）。

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▲圖6 LATE檢測區(qū)分具有不同保真度的 SpCas9變體。（A）NUFF細(xì)胞與編碼野生型wt SpCas9（灰色）或存在突變位點(diǎn)的SpCas9（黑色）的多合一LeGO-CC顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的NUFF細(xì)胞的FC分析比較。紅線標(biāo)記編碼突變 SpCas9 變體的載體的初始轉(zhuǎn)導(dǎo)率。陽性和陰性分別用黃色和藍(lán)灰色表示。（B） 通過 GEF-dPCR 檢測靶向TP53和非靶向 TP53（CYP1A1） 外顯子 4的indel隨時(shí)間推移的相對數(shù)量。

結(jié)論：

這里介紹的LATE檢測結(jié)合GEF-dPCR技術(shù)可以填補(bǔ)基因編輯中的部分空白，作為一種簡單，快速和高性價(jià)比的方法，用于測試給定基因組編輯策略對細(xì)胞生長調(diào)節(jié)的不良影響，評估不同的Cas9核酸酶在基因組編輯時(shí)的特異性。

原文鏈接如下：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8399046/#bib33

期刊介紹：

《molecular therapy》是發(fā)布分子和細(xì)胞療法在糾正遺傳和獲得性疾病研究成果的國際領(lǐng)先期刊。文章涉及基因轉(zhuǎn)移和編輯、載體開發(fā)和設(shè)計(jì)、干細(xì)胞操作、疫苗開發(fā)、臨床前靶點(diǎn)驗(yàn)證、安全性/有效性研究和臨床試驗(yàn)方面等研究領(lǐng)域。