抗體經(jīng)典生物工藝流程

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物藥物的品種與適應(yīng)癥方面不斷優(yōu)化�？贵w藥憑借其藥理活性高、特異性強、治療效果好的特點，在全球醫(yī)藥市場大放異彩。2021年FDA批準的8款抗體新藥中，4款為抗腫瘤藥物，2款為自免藥物，1款為阿爾茲海默癥藥物，1款為降血脂藥物。從藥物形式上看，包含5款單抗，2款A(yù)DC和1款雙抗。
 

 
隨著國內(nèi)抗體藥的發(fā)展，抗體的靶點已由單一靶向轉(zhuǎn)向了多位靶向，抗體開發(fā)趨勢也呈現(xiàn)多樣化，開始更多轉(zhuǎn)向利用雙特異性抗體、抗體藥物偶聯(lián)物和抗體工程等技術(shù)開展，并且抗體純化工藝已相對成熟。

抗體生產(chǎn)工藝經(jīng)典流程圖
 

* 除了低pH孵育和除病毒過濾外，通常會選擇1~2種層析步驟，作為病毒去除的關(guān)鍵步驟。


1. 深層過濾

目前深層過濾開始普遍應(yīng)用在澄清工藝步驟。深層過濾指的是利用多孔介質(zhì)從流動相中截留固體顆粒而不是表面截留，且一般介質(zhì)表面都帶有正電荷，可以通過靜電吸附的方式來攔截雜質(zhì)顆粒。深層過濾介質(zhì)一般由纖維素或聚丙烯纖維柱床、過濾介質(zhì)（如硅藻土）和粘合劑 （用于制作平整的界面）組成。所以深層過濾用于細胞發(fā)酵液的澄清后便可獲得濁度較好的料液。由于深層過濾介質(zhì)的孔徑并不均一，所以在深層過濾之后會緊接一個0.45μm或者0.2μm濾器的2級過濾工藝，以利于后續(xù)的層析純化。工藝時間短，效率高，也有去除更多的雜質(zhì)等優(yōu)勢。目前工藝常用的深層過濾器pall, millipore, 3M的比較多，開發(fā)工藝也比較成熟。開發(fā)參數(shù)主要看Vmax（最大體積）,Tmax（最高濁度）和Pmax（最大壓力）。 

2. 蛋白A層析

此步驟工藝目的是把單抗從培養(yǎng)液中快速的捕獲出來的最關(guān)鍵步驟。因此步驟可以去除大量的HCP，病毒及HCD和培養(yǎng)基組分物質(zhì)。百林科MaXtar ARPA填料的結(jié)合載量可達60mg/ml以上。
 

結(jié)果：MaXtar ARPA填料純化抗體樣品純度達到96.5%，回收率達到99%。

3. 低pH滅活

細胞表達產(chǎn)物有潛在的病毒安全性風(fēng)險，因此要求純化工藝中有至少3種不同原理的病毒清除步驟。通常采用的步驟包括：層析步驟、低pH孵育、納濾等。低pH孵育，即將料液pH值調(diào)節(jié)至約3.4-3.7，維持至少1-2h（維持時間可以根據(jù)目的蛋白的穩(wěn)定性來確定），以實現(xiàn)病毒滅活的目的。有些蛋白在低pH不穩(wěn)定產(chǎn)生聚集，可以考慮加入去污劑，如TNBP/Tween 80等。
 
4. 陽離子層析

陽離子交換層析在純化工藝中起著非常重要的作用，可以達到很好的去除雜質(zhì)效果，尤其是HCP和聚集體去除效果比較明顯。對陽離子交換層析來說，上樣洗脫條件的開發(fā)、填料的篩選對提高產(chǎn)品質(zhì)量來說特別重要。對有些特殊單抗或者雙抗在陽離子交換層析過程中不僅收率低，純度也提不上去，這種情況推薦用疏水填料或者復(fù)合模式填料（MaXtar MMA,MaXtar MMC)來開發(fā)。
 
5. 陰離子層析

由于大部分單抗PI值大于7，在中性pH上樣條件下大部分蛋白帶正電荷，因此，在陰離子交換層析介質(zhì)上表現(xiàn)出流穿模式。在這步驟不僅能去除雜質(zhì)蛋白，聚集體，內(nèi)毒素，最重要的是能去除病毒，更進一步提高藥物安全性。因大部分病毒在pH>7緩沖條件下帶負電荷，可以和帶正電荷的季銨基團結(jié)合，從而達到去除病毒的作用。對雙抗來說，大部分雙抗PI值比單抗低，有的能達到5左右，這時候可以用陰離子結(jié)合洗脫模式來純化。但這時候要注意洗脫緩沖液里面的氯化鈉濃度不能太高，不然會將有些雜質(zhì)，病毒，內(nèi)毒素都洗脫下來，達不到去除雜質(zhì)效果。也可以考慮用復(fù)合填料，比如MaXtar MMA 或者MaXtar MMC。

6. 除病毒過濾

低pH病毒滅活法主要滅活脂包膜病毒，除病毒過濾濾膜既可以去除非脂包膜病毒，還可以去除脂包膜病毒。由于除病毒過濾濾器價格的昂貴和一次性使用的特性，導(dǎo)致除病毒過濾占用了整個生產(chǎn)工藝的很大一部分的成本。因此，優(yōu)化除病毒過濾濾器的載量顯得格外的重要。在病毒過濾過程中，常常發(fā)現(xiàn)由于各種因素可能會導(dǎo)致過濾通量降低，濾器載量降低。從濾器選擇、樣品pH與電導(dǎo)優(yōu)化、樣品濃度選擇和添加劑選擇這四個方面來優(yōu)化濾器的載量，以達到降低生產(chǎn)成本，節(jié)省過濾時間的目的。
 
7. UF/DF

這步驟目的主要是把樣品濃縮后換液到制劑緩沖液里。在這步驟要關(guān)注目的蛋白在高濃度下的穩(wěn)定性和合適的壓力。


訂貨信息

百林科不僅提供各種規(guī)格的層析填料，也提供預(yù)裝柱，以方便快速篩選。
 
 
   
 
參考文獻
（1）A brief introduction of IgG-like bispecific antibody purification: Methods for removing product-related impurities，Yifeng Li，/doi.org/10.1016/j.pep.2018.11.01
（2）A potential downstream platform approach for WuXiBody-based IgG-like bispecifific antibodies Gaili Guo, Jinyu Han, Ying Wang, Yifeng Li, /doi.org/10.1016/j.pep.2020.105647
（3）Removing a light-chain missing byproduct by MMC ImpRes mixed-mode chromatography under weak partitioning mode in purifying a WuXiBody-based bispecific antibody Ting Zhang 1 , Yan Wan 1 , Jiwei Duan, Yifeng Li ，/doi.org/10.1016/j.pep.2021.105927

（4）醫(yī)藥筆記：2021年FDA批準的8款抗體新藥