如何有效避免無處不在的PCR污染

前言

在PCR檢測(cè)過程中，不可否認(rèn)的是，沒有任何檢測(cè)是100%準(zhǔn)確的，比如我們可能也曾聽過假陽性這個(gè)名詞，那為什么會(huì)出現(xiàn)假陽性呢?這其實(shí)跟實(shí)驗(yàn)操作過程造成的污染相關(guān)，在實(shí)驗(yàn)開展過程中，主要有4種污染途徑：標(biāo)本間交叉污染、PCR試劑污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、實(shí)驗(yàn)室克隆質(zhì)粒污染。

如何對(duì)污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)？

1. 陽性對(duì)照

在建立PCR實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對(duì)照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否符合理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志，陽性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)，但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大，因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對(duì)照。

2. 陰性對(duì)照

每次PCR試驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照，它包括：①標(biāo)本對(duì)照，被檢標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清做對(duì)照，被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞做對(duì)照；②試劑對(duì)照，在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)試劑是否污染。

3. 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

4. 選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

如何避免PCR污染？

實(shí)驗(yàn)室防污染是重中之重，畢竟影響最終檢測(cè)結(jié)果，那么我們有哪些防污染的方法呢？

除了注意避免人工操作引入的污染，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)由一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。同時(shí)減少PCR循環(huán)次數(shù)，PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。