On-chip Sort無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀的使用流程與結(jié)果分析

 

近年來(lái)，研究人員注意到細(xì)胞分選后細(xì)胞的變化，如形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞生長(zhǎng)延遲、細(xì)胞活力降低以及基因表達(dá)的改變。這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的細(xì)胞分選技術(shù)是空氣噴射法，這種分選方式很容易引發(fā)細(xì)胞分選后的細(xì)胞應(yīng)激。如何降低或者避免這種分選后細(xì)胞應(yīng)激現(xiàn)象的產(chǎn)生成為細(xì)胞分選的一大挑戰(zhàn)。

On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀是世界上首個(gè)利用微流控芯片技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分選的儀器。這種技術(shù)很好的解決了傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀可能出現(xiàn)的細(xì)胞損傷和細(xì)胞污染等問(wèn)題。

On-chip Sort 技術(shù)的核心是使用一次性的小型微流控芯片，樣品和鞘液分別裝入芯片上的樣品池和鞘液池。傳統(tǒng)的細(xì)胞分選儀需要特定的鞘液，而On-chip Sort 可以選擇適合細(xì)胞的任何鞘液，例如培養(yǎng)基、淡水、海水和油等。

On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀通過(guò)“流動(dòng)移位”機(jī)制進(jìn)行，當(dāng)檢測(cè)到目標(biāo)細(xì)胞接近分選區(qū)域時(shí)，通過(guò)空氣加壓產(chǎn)生短的液體脈沖，將目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到收集池。而非目標(biāo)細(xì)胞則繼續(xù)流動(dòng)進(jìn)入廢液池。這種分選的方法不涉及高壓、噴嘴產(chǎn)生靜電和細(xì)胞高速碰撞等問(wèn)題，所以可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞無(wú)損傷分選。
 

在進(jìn)行細(xì)胞分析和分選的過(guò)程中，所有的液體（包括樣品、鞘液和廢液）都保留在芯片內(nèi)，并不需要外部的儲(chǔ)液裝置。液體流動(dòng)通道和儲(chǔ)液池中的液體都不會(huì)與儀器本身直接接觸，并且芯片也是無(wú)菌的，因此不會(huì)產(chǎn)生樣本間的污染和樣本與儀器之間的污染。

基于空氣噴射和反應(yīng)池混合動(dòng)力為原理的傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀在進(jìn)行細(xì)胞分選時(shí)的多個(gè)步驟都很容易對(duì)細(xì)胞造成破壞或誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。而On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀因?yàn)槲⒘骺匦酒�的設(shè)計(jì)，去除了一些可能會(huì)損傷細(xì)胞的步驟，并且關(guān)鍵還在于其分選壓力比傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀低100多倍，因此可以進(jìn)行更加溫和的細(xì)胞分選，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷。
 

On-chip Sort 被用于多種細(xì)胞類型的細(xì)胞分選，特別是一些非常“脆弱”的不能用其他細(xì)胞分選儀器分選的細(xì)胞。包括神經(jīng)細(xì)胞、iPS衍生細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、精子細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。接下來(lái)，跟大家分享一些利用On-chip Sort 進(jìn)行細(xì)胞分選的結(jié)果。


 

01.  分選對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
為了比較傳統(tǒng)的細(xì)胞分選儀（空氣噴射法）和On-chip Sort（微流控分選法）對(duì)穩(wěn)定的HeLa細(xì)胞分選后的影響，分別用兩種細(xì)胞分選儀對(duì)100個(gè)HeLa細(xì)胞進(jìn)行分選。分選后，將分選的細(xì)胞收集起來(lái)在96孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，并且每天對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
 

圖 1 分選后HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。（照片拍攝于第三天）

利用On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀分選的細(xì)胞在分選后第二天開(kāi)始生長(zhǎng)，并且在第三天細(xì)胞數(shù)量翻倍增長(zhǎng)。另一方面，利用傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀分選的細(xì)胞在分選后第三天才開(kāi)始生長(zhǎng)，與On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀相比，分選后的細(xì)胞生長(zhǎng)較慢。
 

02.  分選對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響
比較傳統(tǒng)的細(xì)胞分選儀和On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀對(duì)極易受到物理?yè)p傷的嗜酸性粒細(xì)胞在分選后的形態(tài)的影響。
 

圖 2 用蘇木精和伊紅染色的外周血嗜酸性粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)圖。分別利用On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀（左）和傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀（右）分選后通過(guò)細(xì)胞涂片進(jìn)行固定。

明顯觀察到分選后細(xì)胞形態(tài)上的變化。利用On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀分選后的嗜酸性粒細(xì)胞基本完好無(wú)損，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持不變。但是，利用傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀分選后的細(xì)胞出現(xiàn)破碎的情況。據(jù)推測(cè)，傳統(tǒng)的細(xì)胞分選儀在分選時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，所以分選后出現(xiàn)細(xì)胞破碎。

03.  分選對(duì)基因表達(dá)的影響
許多研究人員在分析基因表達(dá)之前將細(xì)胞分為多個(gè)亞群體。為了檢測(cè)傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀和On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀的細(xì)胞分選對(duì)基因表達(dá)模式差異的影響，于是，在兩種細(xì)胞分選儀上對(duì)50000個(gè)Caco-2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞進(jìn)行分選。通過(guò)使用未分選細(xì)胞作為對(duì)照的微陣列分析來(lái)確定每種細(xì)胞類型的基因表達(dá)水平變化。
 

圖 3 比較利用On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀（3a）和傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀A（3b）分選后的HeLa細(xì)胞和未分選的HeLa細(xì)胞的基因表達(dá)水平變化。紅點(diǎn)代表上調(diào)基因，綠點(diǎn)代表下調(diào)基因。百分比數(shù)字表示所有基因上調(diào)（紅色）和下調(diào)（綠色）的百分比。（3c）表示通過(guò)On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀和傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀A分選后Caco-2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞未受影響的基因表達(dá)的直方圖。百分比數(shù)字表示所有分類特性（細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期等）的未受影響基因占總基因的比例。表達(dá)變化的比率被定義為分選細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度/未分化細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度。
 

圖 4 具有已確認(rèn)差異的分類特性的基因表達(dá)模式。在每個(gè)屬性中，左列和右列分別表示On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀和傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀的數(shù)據(jù)。黑色表示基因表達(dá)沒(méi)有變化，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)。

圖3a、3b和3c顯示，與傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀相比，On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀對(duì)HeLa細(xì)胞分選后基因表達(dá)變化較小。并且，基因表達(dá)水平上沒(méi)有變化的基因數(shù)量比傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀高3-5倍。圖4顯示的兩種細(xì)胞分選儀之間基因表達(dá)模式的各種差異支持了圖1表示的兩種細(xì)胞分選儀對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率影響的差異這一結(jié)果。盡管基因表達(dá)分析是在兩種類型的細(xì)胞分選后30到60分鐘內(nèi)完成的，但是根據(jù)分選后的進(jìn)程不同，結(jié)果可能有所不同，總的來(lái)說(shuō)，可以觀察到傳統(tǒng)細(xì)胞分選儀和On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀分選后基因表達(dá)的差異。

04.  分選神經(jīng)元
近年來(lái)，與疼痛相關(guān)的神經(jīng)活動(dòng)的研究以及疼痛可視化的研究已經(jīng)發(fā)展到了各個(gè)領(lǐng)域。在背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中發(fā)現(xiàn)的一種稱為DRG神經(jīng)元的感覺(jué)神經(jīng)元（傳入神經(jīng)元）的細(xì)胞體負(fù)責(zé)來(lái)自外界和器官之間的疼痛傳遞。然而，DRG中存在許多其他類型的細(xì)胞，因此它們由異質(zhì)細(xì)胞群組成。由于DRG中存在多種DRG神經(jīng)元類型，細(xì)胞對(duì)疼痛的反應(yīng)是不同的。因此，從異質(zhì)樣本中分離出一種特定類型的DRG神經(jīng)元可以讓研究人員更好地了解其生物化學(xué)和神經(jīng)傳遞的電信號(hào)，還可以有利于藥物開(kāi)發(fā)。
 

圖 5 散點(diǎn)圖（5a）顯示了利用On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀根據(jù)大小從異質(zhì)DRGs細(xì)胞樣本中分選的兩個(gè)單獨(dú)細(xì)胞群（用紅色箭頭表示，命名為“大”和“小”）的閥門。通過(guò)抗-β-微管蛋白III（綠色）和抗突觸素（紅色）染色，確定（5a）中分離的“大”（5b）和“小”（5c）細(xì)胞群中的神經(jīng)細(xì)胞。

從10周齡大鼠收集的DRG細(xì)胞通過(guò)酶處理分離，并在分選前懸浮在神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。根據(jù)大小對(duì)預(yù)處理樣品進(jìn)行分類。從大小分布中觀察到四組細(xì)胞，其中兩組細(xì)胞利用On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀分選并培養(yǎng)五天。這兩個(gè)細(xì)胞群都被多聚甲醛固定，并用抗-β-微管蛋白III和抗突觸素染色，其中，抗-β-微管蛋白III可以識(shí)別神經(jīng)元中的微管蛋白，抗突觸素可以識(shí)別負(fù)責(zé)神經(jīng)傳遞的神經(jīng)元。染色結(jié)果證實(shí)這兩個(gè)細(xì)胞群都是DRG中的活性神經(jīng)細(xì)胞。因此，這些結(jié)果表明，On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀能夠按大小分離DRG神經(jīng)元，同時(shí)保持細(xì)胞活性。

05.  分選誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞
在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，來(lái)自胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）的分化體細(xì)胞被移植給患者。然而，任何剩余的未分化細(xì)胞一旦被植入就會(huì)變成腫瘤，阻礙患者治療的進(jìn)展。因此需要在移植前有效去除未分化的細(xì)胞。On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀通過(guò)一種稱為“多步驟負(fù)分選”的方法，可以有效地去除樣品中少有存在的未分化細(xì)胞。

圖 6 （6a）多步驟負(fù)分選原理。紅點(diǎn)是未分化的細(xì)胞，藍(lán)點(diǎn)是分化的細(xì)胞。（6b）通過(guò)多步驟負(fù)分選從分化的神經(jīng)干細(xì)胞樣品中去除未分化的細(xì)胞。

On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀上的多步驟負(fù)分選通過(guò)加載樣品（與少有的未分化細(xì)胞群混合的分化細(xì)胞）到芯片的樣品池中。未分化的細(xì)胞（非靶細(xì)胞）通過(guò)脈沖流的形成而被去除，流入收集池，而分化的細(xì)胞（靶細(xì)胞）則流入芯片下游的廢液池。分化的細(xì)胞被回收并重新加載到樣品池中進(jìn)行進(jìn)一步純化。重復(fù)這個(gè)過(guò)程直到所有未分化的細(xì)胞被去除。圖6b顯示了含有分化為神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞的樣品中約4%的未分化細(xì)胞被去除。用FITC偶聯(lián)的抗-TRA-1-60熒光標(biāo)記未分化細(xì)胞，熒光信號(hào)用于檢測(cè)。所有未分化的細(xì)胞在三次分選后全部被去除，并且分選的分化細(xì)胞在培養(yǎng)后表現(xiàn)出良好的細(xì)胞活性。

06.  分選細(xì)胞-細(xì)胞混合物
On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀可以分離出通過(guò)弱鍵連接的細(xì)胞，甚至那些很容易被移液管分離吸取的細(xì)胞。圖7顯示了從異質(zhì)細(xì)胞混合物中分離出通過(guò)弱細(xì)胞間相互作用而結(jié)合在一起的細(xì)胞雙復(fù)合體（綠色和紅色細(xì)胞）。
 

圖 7 （7a）異質(zhì)樣品中通過(guò)若細(xì)胞間相互作用結(jié)合在一起的細(xì)胞雙復(fù)合體（綠色和紅色細(xì)胞）的分類。（7b）通過(guò)On-chip Sort 無(wú)損傷流式細(xì)胞分選儀分選前（左）和分選后（右）的樣品。