使用RT-PCR法檢測鼻咽樣品中的新冠病毒

瀏覽次數(shù)：1577　發(fā)布日期：2023-1-6　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一、PCR：

PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis發(fā)明，至今仍廣泛使用的DNA擴(kuò)增技術(shù)。它通過高溫解鏈、低溫退火、中溫?cái)U(kuò)增的過程，來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)片段DNA的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系可以簡單概括為：DNA模板（Template）、引物（Primer）、DNA聚合酶（Polymerase）、三磷酸核苷（dNTPs）及緩沖液。緩沖液中常含氯化鎂等金屬鹽，并可能添加BSA、DTT、甲酰胺等助于聚合酶活性和模板解鏈的試劑，并以PreMix、MasterMix的形式商品化，耐思通用型核酸擴(kuò)增試劑盒可滿足常規(guī)PCR需求。

PCR熱循環(huán)儀是實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的外部硬件，通過程序化的溫度控制，利用金屬浴來按時(shí)加熱、冷卻PCR反應(yīng)體系。DNA雙鏈模板中的氫鍵在高溫下斷裂；溫度降低后，體系中互補(bǔ)引物與模板單鏈重新形成氫鍵結(jié)合，從而產(chǎn)生粘性末端。DNA聚合酶辨識(shí)粘性末端結(jié)合后，在中等溫度下以dNTP為原料在引物后延長DNA鏈。如此產(chǎn)生的DNA鏈在新的一輪循環(huán)中可以作為額外的模板重復(fù)擴(kuò)增反應(yīng)，若干循環(huán)后目標(biāo)DNA片段便實(shí)現(xiàn)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

實(shí)驗(yàn)案例：一個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室PCR實(shí)驗(yàn)

PCR體系的組成：DNA模板（<100ng）、上下游引物（2mM）、dNTPs（2mM）、DNA聚合酶MasterMix（2X）。PCR體系常為20μL或50μL的體積，可置于0.1mL或0.2mL的PCR管中。一個(gè)典型的PCR程序如下：

二、qPCR、RT-PCR、數(shù)字PCR：

傳統(tǒng)PCR技術(shù)僅在終點(diǎn)處檢測產(chǎn)物，因此也叫終點(diǎn)PCR（End-point PCR），常用于克隆、測序及基因分型等。而與之相對(duì)應(yīng)的，在整個(gè)反應(yīng)中都檢測目標(biāo)序列熒光信號(hào)的技術(shù)稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR），簡稱qPCR。qPCR的檢測能力、應(yīng)用范圍相對(duì)于終點(diǎn)PCR都有很大的提高。

qPCR中有嵌入或基于探針的熒光染料在循環(huán)中實(shí)時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物濃度。一系列從低到高濃度的DNA模板參照會(huì)與目標(biāo)模板同步擴(kuò)增，較高濃度的DNA模板在擴(kuò)增過程中會(huì)更快達(dá)到檢測閾值，而擁有較小的CT值（Cycle Threshold）。反應(yīng)結(jié)束后通過繪制對(duì)照DNA模板濃度與CT值的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算目標(biāo)模板初始的濃度，實(shí)現(xiàn)樣品中DNA定量的目的。qPCR的應(yīng)用包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測、基因診斷、腫瘤載量及治療效率檢測等。

基于qPCR的RNA定量技術(shù)稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcriptase PCR），寫為RT-PCR。（由于“實(shí)時(shí)”與“逆轉(zhuǎn)錄”的英文縮寫均為RT，為避免混淆，通常“實(shí)時(shí)”小寫為rt，“逆轉(zhuǎn)錄”大寫為RT。）RT-PCR通過逆轉(zhuǎn)錄RNA形成互補(bǔ)DNA（Complementary DNA，cDNA）后以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病毒載量檢測等。

模擬實(shí)驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR法檢測鼻咽樣品中的新冠病毒

檢測新冠病毒的引物和檢測探針序列設(shè)計(jì)可以圍繞包膜（Envelope，E）、核衣殼（Nucleocapsid，N）、RNA聚合酶（RdRp）或復(fù)制酶基因（ORF1ab），其中N和ORF1ab的序列在中國疾控中心的網(wǎng)站上有公開。

1. 使用鼻咽拭子在鼻粘膜或咽部采樣，置于2mL病毒轉(zhuǎn)移液（VTM）采樣管中

2. 取采樣后的樣品液200μL使用RNA提取試劑盒提取樣品，大量樣品可以使用磁珠法病原微生物基因組核酸提取試劑盒及配套儀器自動(dòng)提取。

3. 使用2.5×RT-qPCR預(yù)混液(多重-探針法）試劑盒中的預(yù)混液（10μL）與引物、探針（5μL）和提取樣品（10μL）配置25μL反應(yīng)體系，同步準(zhǔn)備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的參照體系。

4. 熱循環(huán)儀的程序可大致設(shè)定為55℃ 5min逆轉(zhuǎn)錄，95℃ 5min預(yù)變性，45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：95℃ 5sec、60℃ 15sec、72℃ 15sec。進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

5. 最后用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中RNA模板的濃度，參照CT值標(biāo)準(zhǔn)判斷是否陽性。

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是基于終點(diǎn)PCR與qPCR發(fā)展而來的第三代核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)現(xiàn)核酸分子的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR可以理解為將一個(gè)終點(diǎn)PCR體系分散成數(shù)以萬計(jì)的微PCR反應(yīng)，每個(gè)微系統(tǒng)體積為納米級(jí)，且理論上僅含若干個(gè)、1或0個(gè)目標(biāo)核酸分子。在熱循環(huán)反應(yīng)完畢后，用熒光檢測系統(tǒng)記錄微流控芯片上每個(gè)微系統(tǒng)的擴(kuò)增情況，最后以泊松分布模型來計(jì)算初始體系中核酸分子的數(shù)量，可謂是生物分子檢測與統(tǒng)計(jì)學(xué)的完美結(jié)合。dPCR已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、轉(zhuǎn)基因成分定量、單細(xì)胞基因表達(dá)、環(huán)境微生物檢測等領(lǐng)域。

附：可使用到的耐思產(chǎn)品