柱層析常見的幾種方法

 柱色譜法是一種常用于分離復(fù)雜混合物中分子的方法。與平面色譜不同，在柱色譜中固定相或樹脂被填充到色譜柱中。然后流動相通過填充的固定相以實現(xiàn)分離。這種分離的目的可以是分析性的或制備性的。柱層析在玻璃、塑料或金屬柱內(nèi)的填充三維固定相上進行，可用于制備和分析目的。柱層析技術(shù)包含基于不同固相和液相化學(xué)和柱配置的廣泛應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)精確分析以及分離難以或不可能通過其他方法分離的復(fù)雜混合物。

       有許多系統(tǒng)可用于液相色譜，系統(tǒng)的選擇取決于所需分離的復(fù)雜性。流動相可以通過重力流、使用離心力或使用基于泵的自動系統(tǒng)通過固定相�；�于泵的系統(tǒng)范圍從由蠕動泵和餾分收集器組成的更簡單的低壓色譜系統(tǒng)到復(fù)雜的中壓色譜系統(tǒng)和包括多波長檢測器和緩沖液混合功能的高壓液相色譜系統(tǒng)。因此，柱色譜根據(jù)所用流體流動系統(tǒng)的類型進行分類：重力色譜、低壓層析、中壓色譜（包括快速蛋白液相色譜）、高壓/高效液相色譜(HPLC)。其中，重力色譜通常用于小規(guī)模的制備色譜。低壓和中壓色譜系統(tǒng)通常用于中等規(guī)模的制備應(yīng)用。中壓系統(tǒng)用途更廣可用于分析和制備目的。高壓系統(tǒng)允許對蛋白質(zhì)或小分子進行高分辨率分離，最常用于分析目的。

一、重力色譜：
       重力色譜利用重力使樣品和緩沖液通過分析柱的樹脂。盡管預(yù)裝重力柱在市場上有售，但實驗室自己裝柱填充的情況并不少見。重力色譜法是一種低成本、簡單的制備色譜法，但它不能提供高分辨率。重力色譜可應(yīng)用于核酸、肽和蛋白質(zhì)的小規(guī)模、快速制備層析等方面。

二、低壓層析：
       低壓層析系統(tǒng)在低于 50 psi (0.35 MPa) 的壓力下運行。這些系統(tǒng)需要一個樣品泵并且通常配備餾分收集器、梯度能力和檢測器來監(jiān)測柱洗脫。低壓系統(tǒng)與預(yù)裝柱兼容，并提供比重力色譜更大的靈活性和更高的分辨率。盡管如此，低壓層析并不是一種適用于復(fù)雜蛋白質(zhì)純化的高分辨率層析方法。低壓層析應(yīng)用于天然或重組蛋白質(zhì)的中等規(guī)模制備層析。

三、中壓色譜：
      中壓色譜，也稱為快速蛋白液相色譜，更適用于復(fù)雜的純化，也可用于分析目的。中壓色譜法是在實際上相當(dāng)高的操作壓力下進行的，最高可達(dá) 3500 psi (24 MPa)。中壓色譜系統(tǒng)通常包括附加功能，例如柱切換閥、高級梯度功能和多波長檢測器。這些系統(tǒng)與各種預(yù)裝柱和樹脂兼容，中壓色譜可應(yīng)用于簡單的重組蛋白純化以及從非揮發(fā)性有機物到核酸、肽和蛋白質(zhì)的分析目的。

四、高壓液相色譜：
       高壓液相色譜法 (HPLC)也稱為高效液相色譜法，是在高達(dá) 5,000 psi (34 MPa)的壓力下進行的。HPLC 是一種強大的分析工具，具有高分辨率和靈敏度，能夠檢測低至萬億分之一的濃度，同時具有非常小的樣品需求。由于 HPLC 系統(tǒng)可以在更高的壓力下運行，因此可以減小樹脂的粒徑，從而提高樹脂的分辨率。

     使用 HPLC 分析的化合物種類很多，所以HPLC 系統(tǒng)通常具有多種類型的檢測器。一種常見的組合是紫外吸光度檢測器與蒸發(fā)光散射檢測器 (ELSD) 和/或質(zhì)譜儀 (MS) 的組合。HPLC 和質(zhì)譜法的結(jié)合產(chǎn)生 HPLC-MS，通�？s寫為 LC- MS，一種非常強大的分析工具，用于環(huán)境采樣、藥物發(fā)現(xiàn)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究等應(yīng)用。