酶聯(lián)/熒光免疫斑點(diǎn)分析技術(shù)在應(yīng)用中的常見問題分析與解答

一、 ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)）/FluoroSpot（熒光免疫斑點(diǎn)技術(shù)）的區(qū)別
 

 ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)）
 

 FluoroSpot（熒光免疫斑點(diǎn)技術(shù)）

FluoroSpot是在ELISpot基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，使用熒光檢測(cè)代替比色法。熒光免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)合了ELISpot的靈敏性和同時(shí)分析幾種分析物分泌的能力，適用于單次檢測(cè)和大規(guī)模篩選不同功能特征的細(xì)胞群檢測(cè)。熒光免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)是將夾心法與熒光標(biāo)記檢測(cè)法相結(jié)合，對(duì)同一孔內(nèi)的兩種或多種分析物進(jìn)行檢測(cè)。 
 

案例說明：通過ELISpot和FluoroSpot分析檢測(cè)分析食蟹獼猴外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分泌的IFN-γ和IL-2。PBMC僅在培養(yǎng)基中孵育過夜，或用恒河猴巨細(xì)胞病毒pp65或抗cd3單抗刺激。

A)    ELISpot：使用單抗組合MT126L和7-b6-1-生物素和IL-2使用單抗組合MTA91/MT2C95和MT8g10-生物素進(jìn)行分析。

B)FluoroSpot：IFN-γ和IL-2使用與ELISpot相同的抗體，但在相同的井中。所示圖像代表了490/550的IFN- γ響應(yīng)，以及550/570 nm的IL-2響應(yīng)。圖中還顯示了IFN-γ和IL-2圖像（IFN-γ + IL-2）的計(jì)算機(jī)覆蓋分析，其中雙產(chǎn)生細(xì)胞顯示為黃色斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行，結(jié)果具有可重復(fù)性。

 

二、 ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)）相關(guān)問題答疑
ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)）是一種基于ELISA基本原理建立的、高靈敏的細(xì)胞因子方法，能夠?qū)�抗原刺激后的活�?xì)胞進(jìn)行功能性檢測(cè)，具有較髙的特異性、直觀可信度髙，并且易操作，已被廣泛用于細(xì)胞因子分泌細(xì)胞（CK）或抗體分泌細(xì)胞（ASC）測(cè)定中，在國(guó)內(nèi)外免疫學(xué)界獲得了廣泛的應(yīng)用。
 

該檢測(cè)技術(shù)主要的分析步驟有：樣本制備、包被單抗、細(xì)胞+抗原刺激+孵育、檢測(cè)抗體的加入與孵育、顯色與讀板。本期就結(jié)合以上主要操作流程，對(duì)常見的ELISPOT應(yīng)用中常見的問題進(jìn)行分析與解答。

 

1.    樣本制備

1.1 可檢測(cè)的細(xì)胞類型有哪些？

原則上，任何可以分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞都可以進(jìn)行檢測(cè)：
貼壁細(xì)胞在進(jìn)行檢測(cè)步驟之前，需要進(jìn)行裂解步驟，以從ELISPOT板上去除所有細(xì)胞；
新鮮和冷凍保存的PBMC都可用于ELISPOT和FluoroSpot分析；
對(duì)于T細(xì)胞，強(qiáng)烈建議使用新鮮的嚙齒動(dòng)物脾臟細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，因?yàn)樵摷?xì)胞的冷凍保存過程太復(fù)雜，并且冷凍保存對(duì)脾細(xì)胞活力和功能有負(fù)面影響。

目前主要用于鑒定：抗原激活分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞，外周血&脾臟細(xì)胞中分泌抗體的B細(xì)胞。
 

1.2 可以檢測(cè)哪些品種的樣本？

需要確定待測(cè)物種是否能產(chǎn)生想要研究的細(xì)胞因子，一些動(dòng)物樣本只有在體內(nèi)受到適當(dāng)抗原刺激后，才會(huì)分泌細(xì)胞因子。ELISPOT是體外檢測(cè)，故而可能不滿足一些特定的分泌條件。

 

1.3 血液儲(chǔ)存及運(yùn)輸條件

全血樣本應(yīng)在室溫（20-26℃）條件下，儲(chǔ)存不超過8小時(shí)；
抗凝血?jiǎng)┩扑]肝素+檸檬酸鹽，這兩種物質(zhì)，在測(cè)定中沒有報(bào)告對(duì)細(xì)胞功能的不利影響。
不推薦EDTA（EDTA通過鈣螯合抑制凝血，鈣螯合在抗原特異性再刺激期間損害細(xì)胞因子誘導(dǎo)）。
 

 

1.4 使用PBMC樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，有哪些需要注意的事項(xiàng)？

首先，單核細(xì)胞作為T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞（APC）至關(guān)重要，單核細(xì)胞數(shù)量過少會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞ELISPOT/FluoroSpot測(cè)定中的斑點(diǎn)數(shù)降低，特別是冷凍保存的樣本
，因此需補(bǔ)充單核細(xì)胞。
其次，PBMC制劑中死細(xì)胞的存在會(huì)影響T細(xì)胞與B細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果，建議在樣本制備時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞活率。細(xì)胞活率大于80%的樣本即可進(jìn)行檢測(cè)，否則由于操作過程中的損失及自然凋亡，最后檢測(cè)時(shí)形成的斑點(diǎn)數(shù)也會(huì)減少。

 

人IFN-γ T細(xì)胞ELISPOT結(jié)果示例（銀染）：2x105PBMC/孔
   
單核細(xì)胞耗盡樣品

正常樣品

 

2.    單抗包被

2.1 適合進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)的抗體有哪些？
在 ELISA 系統(tǒng)中最適合的一抗和二抗并不意味著這些抗體也是 ELISPOT 測(cè)定的最佳抗體。ELISPOT抗體對(duì)由制造商在廣泛的優(yōu)化和驗(yàn)證的基礎(chǔ)上選擇，并應(yīng)用作ELISPOT測(cè)定的匹配抗體對(duì)。
 

2.2抗體包被耗時(shí)多久？
包被好的檢測(cè)板，需放置在加濕室（卡盒塑料容器，底部有濕紙巾），4℃的條件下過夜保存。

2.3抗體包被應(yīng)在何時(shí)進(jìn)行？
抗體的包被可以提前7天進(jìn)行，涂覆后使用無菌PSB洗滌，并用封閉溶液進(jìn)行封閉。使用封板摸密封的ELISPOT板應(yīng)及時(shí)儲(chǔ)存在4℃，防止蒸發(fā)，若需長(zhǎng)時(shí)間保存，則應(yīng)保證環(huán)境無菌。

 

2.4 包被結(jié)束后各種試劑如何保存？

封閉液可以在室溫放置數(shù)小時(shí)，或者4℃保存
檢測(cè)抗體在室溫下放置2小時(shí)，或者4℃保存
偶聯(lián)物需避光保存，室溫下放置1小時(shí)，或者4℃保存

3.    細(xì)胞+抗原刺激+預(yù)孵育
3.1 單孔需添加的細(xì)胞數(shù)量建議值？
ELISPOT和FluoroSpot檢測(cè)的靈敏度在很大程度上取決于細(xì)胞密度。
細(xì)胞數(shù)量是否太少，則不足以獲得最佳反應(yīng)；過多的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致單個(gè)斑點(diǎn)重疊和高背景染色。
因此我們建議，在添加細(xì)胞樣本之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，保證細(xì)胞密度不超過3x10E5/mL 。

 

人IgG B細(xì)胞ELISPOT結(jié)果示例（酶染色）：
在體外預(yù)孵育步驟中用IL-2和R848激活記憶B細(xì)胞。
顯示：IgG分泌細(xì)胞的總數(shù)。
 

5x10E3個(gè)斑點(diǎn)   

 

5x10E5個(gè)斑點(diǎn)（太多斑點(diǎn)無法計(jì)數(shù)）
 

3.2 刺激后的孵育時(shí)間需要多久？
一般來說，孵育的時(shí)間在12-48h之間，建議是在16h左右，也需根據(jù)細(xì)胞因子免疫反應(yīng)強(qiáng)度來判斷：如果免疫反應(yīng)較強(qiáng)，則孵育12h；若反應(yīng)較弱，則孵育48h。此外應(yīng)注意，長(zhǎng)時(shí)間的孵育（48h-72h）可能會(huì)導(dǎo)致板底PVDF膜滲漏。

 

T細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)：
當(dāng)使用全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或長(zhǎng)肽用作為ELISPOT測(cè)定中的刺激物，且細(xì)胞密度>10E6/well/mL時(shí)，可能需要24-42小時(shí)的孵育。
�。ê铣桑╇模�8-12聚體）可以由APC直接呈遞給CD8+細(xì)胞，因此不需要預(yù)育步驟。

 

B細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)：
靜止記憶B細(xì)胞在體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生大量抗體。因此，在高細(xì)胞密度（>10E6cell/well/mL）的條件下，根據(jù)細(xì)胞類型的不同，所需的預(yù)孵育時(shí)間在2-5天左右。

3.3如何設(shè)置合理的對(duì)照？
陽性對(duì)照——細(xì)胞經(jīng)特異性抗原或多克隆抗體刺激  用來確定試劑盒正常工作，細(xì)胞功能完整；排除假陰性結(jié)果
陰性對(duì)照——細(xì)胞不經(jīng)刺激  用來確定自發(fā)分泌因子的細(xì)胞個(gè)數(shù)；排除假陽性結(jié)果
背景對(duì)照——不加細(xì)胞和其他所有試劑  用來排除試劑或其他介質(zhì)的影響產(chǎn)生的斑點(diǎn)；排除假陽性結(jié)果

 

 

3.4完成加樣及刺激后，單孔的體積是多少？
在結(jié)束細(xì)胞鋪板與抗原刺激后，需確認(rèn)并檢查整個(gè)實(shí)驗(yàn)的體系是否正確，包括溶液的體積、標(biāo)簽及排布，其中單孔體積（總計(jì)200μ）應(yīng)包含：100μL單細(xì)胞懸液，100μL抗原刺激物。

3.4使用具有傳染性病的原體時(shí)，如何對(duì)細(xì)胞板進(jìn)行凈化？

如果附有PVDF膜的ELISPOT板中，發(fā)生了污染，諸如包膜病毒（例如HIV，SIV）的感染因子，則可以在首選的細(xì)胞孵育時(shí)間后對(duì)孔進(jìn)行去污，。
首先從孔中吸取出細(xì)胞，然后用加了300μl4%多聚甲醛的PBS洗滌5次 ，然后在室溫（20-26°C）下孵育，<5分鐘，之后ELISPOT板可以繼續(xù)進(jìn)行其他的清洗步驟。
這些清洗步驟可能導(dǎo)致略高的背景染色，但對(duì)T細(xì)胞ELISPOT測(cè)定中的斑點(diǎn)數(shù)量和大小不會(huì)產(chǎn)生不利影響。

 

3.5 在孵育時(shí)，培養(yǎng)箱容積不足，可以堆疊放置ELISPOT板嗎？

不可以，堆疊拜訪可能會(huì)造成單孔溫度變化不均，導(dǎo)致最后形成的斑點(diǎn)大小、數(shù)量發(fā)生變化。

 

3.6 ELISPOT 常見細(xì)胞及刺激劑

4.    檢測(cè)抗體的加入與孵育

4.1整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都需要在超凈臺(tái)/生物安全柜中進(jìn)行嗎？
前期的包板、孵育、加樣、刺激等操作，均需要保持操作環(huán)境無菌，此后都不強(qiáng)制要求保持無菌，檢測(cè)抗體、顯色液、緩沖液的加入均可在一般實(shí)驗(yàn)環(huán)境下進(jìn)行。

 

4.2孵育條件？

在4℃保濕箱中儲(chǔ)存18小時(shí)

5.    顯色與讀板

5.1 該技術(shù)可檢測(cè)的斑點(diǎn)類型？
ELSPOT是基于酶標(biāo)的顯色原理，F(xiàn)luoroSpot是基于熒光的顯色原理，所以最后的檢測(cè)斑點(diǎn)會(huì)有所不同。
ELISPOT的酶標(biāo)記物可以是HRP或者ALP
對(duì)應(yīng)的顯色底物分別是：BCIP/NBT、Fast red、TMB、AEC

FluoroSpot的熒光標(biāo)記物較為常見的有FITC、CY3等
 
（優(yōu)寧維提供AID酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀，在標(biāo)配FITC、CY3通道之外，可根據(jù)標(biāo)記物不同選配其他通道）

5.2 可以被判定為分泌了細(xì)胞因子的斑點(diǎn)有什么特點(diǎn)？如何避免誤判？

真正的由于細(xì)胞因子分泌沉淀形成的斑點(diǎn)應(yīng)具有致密的中心以及蛋白質(zhì)擴(kuò)散產(chǎn)生的輕外環(huán)，光斑大小在5000-10000平方微米；小而暗、邊緣鋒利、強(qiáng)度均勻、人工斑點(diǎn)與污垢、都不是真正的斑點(diǎn)。
因此，在使用軟件進(jìn)行結(jié)果評(píng)估時(shí)，需要為要計(jì)數(shù)的最小光斑尺寸設(shè)置不同分析的截止值，并且必須定義最大光斑尺寸以識(shí)別細(xì)胞簇，為每種不同的ELISPOT/FluoroSpot測(cè)定建立絕對(duì)設(shè)門標(biāo)準(zhǔn)。最小和最大“門”集將嚴(yán)重影響計(jì)數(shù)的點(diǎn)數(shù)。

5.3 產(chǎn)生條紋狀斑點(diǎn)的原因？
首先，某些刺激觸發(fā)趨化因子的釋放，導(dǎo)致T細(xì)胞在孵育期間四處移動(dòng)，在孔中產(chǎn)生細(xì)胞因子痕跡，當(dāng)T細(xì)胞被多克隆刺激（如絲裂原和抗CD3 / CD28抗體）激活時(shí)尤其如此。
其次，細(xì)胞孵育過程中板的運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致細(xì)胞滾動(dòng)，從而產(chǎn)生不規(guī)則或長(zhǎng)方形斑點(diǎn)。

 

5.4 成像結(jié)果出現(xiàn)小黑點(diǎn)的原因？
如果經(jīng)過目視評(píng)估，這些“斑點(diǎn)”大小不一、高度不規(guī)則，則孔中可能存在灰塵顆粒。通過將 4-5 bar 的壓縮空氣吹入井孔中，可以輕松解決這個(gè)問題。

5.5 顯色后檢測(cè)板的干燥與儲(chǔ)存條件？

顯色結(jié)束后，應(yīng)將去除封板膜，將檢測(cè)板倒置，在室溫（20-26℃）下避光干燥，以防止光照導(dǎo)致斑點(diǎn)漂白。