片段分析儀助力食道癌綜合性RNA數(shù)據(jù)集分析研究

食道癌（EAC）是全球第六高致死率的癌癥。巴雷特食管癥（NDB）是已知的EAC前體病變，表現(xiàn)為食管的正常鱗狀粘膜被柱狀上皮覆蓋。其可經(jīng)歷低度異性增生（LGD）到高度異型增生（HGD），最終發(fā)展到食道癌。在過去的幾十年里，食道癌的發(fā)病率急劇增加。因此迫切的需要更好地了解疾病的病因，并識別新的預(yù)后和預(yù)測性生物標(biāo)志物，以提高患病的生存概率。在本文中，科學(xué)家們選取了17位不同的食道癌患者的樣本，進(jìn)行了綜合的數(shù)據(jù)分析�；�于這些數(shù)據(jù)，共形成了3種生物型，共有119個(gè)表達(dá)譜，包括miRNA（51）、mRNA（51）和circRNA（17）。善用這種獨(dú)特的數(shù)據(jù)資源，有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和疾病機(jī)制，進(jìn)行組織和液體活檢的比較，整合編碼和非編碼RNA模式，此外還可以作為其他基于RNA研究的驗(yàn)證方式。此外，在該數(shù)據(jù)集中還可以識別出結(jié)構(gòu)RNA的差異，包括蛋白質(zhì)編碼突變、融合基因和環(huán)狀RNA。該文由比利時(shí)根特大學(xué)Katleen De Preter團(tuán)隊(duì)于2022年3月在Nature 子刊scientific data 上發(fā)表。

圖 1 實(shí)驗(yàn)線路設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)方法：

患者樣本收集
該項(xiàng)目收集4名食道癌患者（EAC），5名高度異型增生患者(HGD)和8名非增生巴雷特食道癥患者(NDB）的共51份血液組織樣本。所用樣本均在治療前采集。組織樣本是在內(nèi)鏡檢查（NDB和HGD）或腫瘤手術(shù)切除（EAC）期間獲得的。從病變組織區(qū)收集至少一個(gè)組織樣本被送去進(jìn)行病理檢查。若收集到非目標(biāo)疾病或健康樣本則會使用RNAlater（Qiagen 76104 RNA保存液）進(jìn)行長期保存。血液樣本使用6 ml EDTA管收集，然后用9 ml檸檬酸鈉（3.2%）真空血管進(jìn)行采血。1800g離心10 min制備血漿

RNA提取
組織樣本：采用miRNeasy mini kit （Qiagen 貨號217004）抽提總RNA。提取后的RNA由QUBIT進(jìn)行濃度測定，由安捷倫片段化分析儀進(jìn)行RNA 完整性質(zhì)控。其中高達(dá)70.6%的樣本的RNA完整性水平大于質(zhì)控?cái)?shù)字指標(biāo)7，表示質(zhì)量較好。
血漿樣本：采用miRNeasy Serum/Plasma Kit （Qiagen 貨號217184）提取RNA，其中用來mRNA捕獲測序的樣本還進(jìn)行g(shù)DNA去除。

測序

組織樣本：PolyA+ RNA 測序
采用TruSeq Stranded mRNA Library Prep kit （Illumina）進(jìn)行測序文庫構(gòu)建，上樣量為100 ng。用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行文庫質(zhì)控，終文庫在NextSeq 500（Illumina）儀器上進(jìn)行paired-end測序。

血漿樣本：mRNA捕獲測序
使用TruSeq RNA Access Library Prep Kit (Illumina,現(xiàn)已更名為TruSeq RNA Exome)進(jìn)行文庫制備，上樣量為8.5 µl RNA洗脫液。使用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行文庫質(zhì)控。樣品在NextSeq 500（Illumina）儀器上進(jìn)行paired-end測序。對所有樣本進(jìn)行了兩次測序，以獲得適當(dāng)?shù)臏y序深度。
 

Small RNA 測序
使用NEBNext  small RNA library prep kit進(jìn)行文庫制備，上樣量為100 ng （組織樣本）和 6 µl 總RNA（血漿樣本）。采用Pippin Prep系統(tǒng)，選擇含有成熟miRNAs（~147-157nt片段）文庫根據(jù)qPCR定量進(jìn)行歸一化并進(jìn)行匯總，并且用乙醇沉淀濃縮，用Qubit 2.0熒光儀定量。在NextSeq 500（Illumina）儀器上對組織和血漿樣本進(jìn)行單端測序。

 圖 2 數(shù)據(jù)的技術(shù)驗(yàn)證 a）RNA原始reads測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量圖：mRNA組織和血漿數(shù)據(jù)的每個(gè)堿基平均質(zhì)量（上行），以及miRNA組織和血漿數(shù)據(jù)（下行）； b)基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)的mRNA血漿樣本的分層聚類，顯示了EAC樣本與HGD和NDB樣本的聚類； c）熱圖顯示組織（左）和血漿（右）樣本中35個(gè)重疊的不同表達(dá)基因（上下）的相對表達(dá)量； d）血漿中十大豐富環(huán)狀RNA的相對表達(dá)（EAC vs NDB）； e）與匹配的健康食管組織相比，四種最常見的EAC、HGD和/或NDB組織樣本中上調(diào)和下調(diào)的miRNAs

表 1 組織樣本（包括19734個(gè)基因和676個(gè)miRNAs）和血漿樣本（11255個(gè)基因，457個(gè)miRNAs和2275個(gè)環(huán)狀RNA）的表達(dá)和豐度分析結(jié)果

結(jié)論：
1、基因表達(dá)和豐度分析
對組織和血漿中的mRNA、miRNA和環(huán)狀RNA進(jìn)行了同源基因表達(dá)和豐度分析。不同表達(dá)基因的數(shù)量見表1。預(yù)處理后的數(shù)據(jù)也被上傳到R2 Genomics Analysis and Visualization Platform 中(http://r2.amc.nl)，可對數(shù)據(jù)集的進(jìn)一步探索和可視化。在本研究中，我們在EAC、HGD和NDB患者的血漿中鑒定了幾種環(huán)狀RNA，它們的環(huán)狀結(jié)構(gòu)更能抵抗外切酶的RNA降解，因此這種類型的RNA作為循環(huán)生物標(biāo)記物具有很大的潛力。雖然我們關(guān)注使用小RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行miRNA表達(dá)和豐度分析，但其他小RNA如tRNA（片段）和piRNA也可以使用我們的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
 

2、相關(guān)miRNA和mRNA的表達(dá)
該數(shù)據(jù)集包含了匹配疾病和健康組織樣本的miRNA和mRNA數(shù)據(jù)。因此，我們在數(shù)據(jù)中可以研究miRNA和mRNA表達(dá)之間的關(guān)系。例如，已知Hedgehog（HH）信號通路在EAC和NDB60中發(fā)揮重要作用。在NDB中，hsa-miR-194表達(dá)的增加導(dǎo)致SUFU的丟失，從而導(dǎo)致Sonic Hegdgehog（SHH）基因的上調(diào)。在我們的NDB組織數(shù)據(jù)以及EAC和HGD組織樣本中，也觀察到與健康組織相比，hsa-miR-194和SHH的表達(dá)上調(diào)，以及SUFU的表達(dá)下調(diào)。這種獨(dú)特的數(shù)據(jù)集可對疾病和健康部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行匹配，以便進(jìn)一步探索相關(guān)通路，即通過使用miRNA和mRNA數(shù)據(jù)。
 

3、突變分析
基于polyA+測序數(shù)據(jù)（組織）和mRNA捕獲測序數(shù)據(jù)（血漿），進(jìn)行突變分析。疾病特異性變異被嚴(yán)格篩選。隨后，這些變異與血漿中的變異進(jìn)行分析。在2例EAC患者、5例 HGD患者和4例NDB患者的血漿中，共發(fā)現(xiàn)了24個(gè)變異。每個(gè)患者發(fā)現(xiàn)1-7個(gè)變異，但在疾病組內(nèi)或組間沒有觀察到重疊。根據(jù)前列腺癌（COSM5564582）、宮頸癌或膽道癌（COSM5493837）或大腸癌（COSM5756079）的COSMIC 數(shù)據(jù)庫，樹狀變異是已知的腫瘤突變。這些結(jié)果證明了該數(shù)據(jù)集能夠在血漿RNA測序數(shù)據(jù)中識別可能的體細(xì)胞突變或疾病特異性RNA編輯事件。
 

4、融合基因分析
EAC組織中融合基因分析的研究報(bào)道很少。在本文中，科學(xué)家們展示了檢測EAC、HGD和NDB組織和血漿樣本的融合基因的潛力。在組織樣本中，在所有樣本中都發(fā)現(xiàn)了潛在的融合基因。通過排除（在每個(gè)樣本的基礎(chǔ)上）在健康組織中也發(fā)現(xiàn)的融合基因，我們確定了疾病特異性的融合基因。對于所有的樣本，有2-14個(gè)融合基因保留（不包括潛在的假陽性）。對于血漿樣本，在一個(gè)HGD患者樣本和兩個(gè)NDB患者樣本中識別出潛在的融合基因，其中有兩個(gè)重疊的融合基因（ID5_HGD和ID19_NDB）。疾病組織與血漿樣本之間沒有融合基因的重疊。科學(xué)家們?nèi)匀恍枰�進(jìn)一步驗(yàn)證這些潛在相關(guān)的融合基因。

本文好物推薦
在文章中科學(xué)家多次使用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行樣本RNA完整性以及測序文庫質(zhì)控。該分析儀為平行毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，共有三個(gè)型號，5200,5300和5400.以5200型號為例。可在 15 分鐘內(nèi)平行分離 12 個(gè)樣品。 該系統(tǒng)旨在消除實(shí)驗(yàn)室的瓶頸，讓您更加專注于結(jié)果。5200 片段分析儀系統(tǒng)可對 gDNA、小 RNA、cfDNA、大片段 DNA 和總 RNA 等多種樣品進(jìn)行 DNA QC 和 RNA QC。這些系統(tǒng)可以分離樣品類型的多樣性使這些儀器成為個(gè)性化工作流程的理想工具，包括 NGS 文庫 QC 和 CRISPR 工作流程。