hACE2人源化小鼠在長春獸醫(yī)研究所新冠疫苗開發(fā)上取得新進(jìn)展中的應(yīng)用

新冠（COVID-19）大流行已持續(xù)三年，全球感染病例超過6.7億例，死亡病例超過670萬例。世界衛(wèi)生組織在不久前宣布，盡管新冠大流行可能正接近轉(zhuǎn)折點(diǎn)，但仍然構(gòu)成“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”。因此，目前迫切需要一種有效的疫苗來預(yù)防新冠病毒（SARS-CoV-2）。

近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所團(tuán)隊(duì)在新冠疫苗開發(fā)上取得新進(jìn)展。他們?cè)凇?em>International Journal of Molecular Sciences》雜志上發(fā)表論文，強(qiáng)調(diào)了S蛋白R(shí)BD三聚體在新冠疫苗開發(fā)中的重要性，并為開發(fā)針對(duì)RBD結(jié)構(gòu)域的保護(hù)性疫苗提供了理論依據(jù)。
 

來源：《International Journal of Molecular Sciences》
（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36430190/）

研究材料與方法
研究人員選擇了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組的RBD蛋白三聚體。在純化和鑒定蛋白后在hACE2人源化小鼠（賽業(yè)生物提供）上開展了動(dòng)物免疫接種實(shí)驗(yàn)，并通過ELISA分析評(píng)估了SARS-CoV-2特異性抗體的水平。隨后用病毒感染的hACE2小鼠評(píng)估RBD-6HB疫苗的保護(hù)作用，作者通過RT-qPCR方法檢測了病毒載量，并開展了組織學(xué)分析。

技術(shù)路線
01 設(shè)計(jì)和構(gòu)建表達(dá)RBD-6HB的重組桿狀病毒
02 對(duì)RBD-6HB重組蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化和鑒定
03 在hACE2小鼠上評(píng)估RBD-6HB疫苗的免疫原性
04 評(píng)估RBD-6HB疫苗對(duì)hACE2小鼠的保護(hù)作用

研究結(jié)果
1 RBD-6HB重組蛋白的構(gòu)建和表達(dá)
眾所周知，新冠病毒進(jìn)入細(xì)胞是由S（刺突）蛋白介導(dǎo)的，S蛋白自組裝成同源三聚體，在病毒表面形成特殊的花冠結(jié)構(gòu)。S蛋白上的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）與宿主細(xì)胞的ACE2受體結(jié)合，因此可作為開發(fā)中和抗體的主要目標(biāo)。

研究人員推測，與原生結(jié)構(gòu)相似的三聚體可能會(huì)增加RBD的免疫原性，因此，他們將六螺旋束（6HB）添加到RBD蛋白的C端，使其形成穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)。6HB是一種熱穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)域，來源于HIV的gp41蛋白，在此作為“分子鉗”以增加病毒蛋白的穩(wěn)定性。他們選擇桿狀病毒系統(tǒng)來表達(dá)去糖基化的RBD蛋白（RBDΔN1）與6HB的融合體，因?yàn)槿コ�糖基化位點(diǎn)可增加蛋白表達(dá)，并維持其抗原性和功能。
 

三種重組桿狀病毒的示意圖

重組桿狀病毒rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB以及對(duì)照（RBD和6HB）的構(gòu)建過程如圖1所示。研究人員用重組桿狀病毒感染sf9細(xì)胞后，開展Western blot分析，發(fā)現(xiàn)RBD-6HB蛋白在感染的細(xì)胞中有效表達(dá)。他們?cè)谑占�培養(yǎng)上清液后進(jìn)行蛋白純化，獲得了純度高達(dá)97%的蛋白質(zhì)。他們還發(fā)現(xiàn)，RBD-6HB蛋白能夠形成三聚體（分子量約為120 kDa），這一點(diǎn)通過SDS-PAGE和Western blot得到了驗(yàn)證。

2 RBD-6HB疫苗對(duì)小鼠的完全保護(hù)
之后，研究人員在hACE2人源化小鼠上評(píng)估了RBD-6HB三聚體的免疫原性，這種穩(wěn)定表達(dá)人類ACE2受體的人源化ACE2小鼠是由賽業(yè)生物構(gòu)建的。他們將6周齡的hACE2小鼠隨機(jī)分為三組，將指定的蛋白和佐劑注射到小鼠體內(nèi)。加強(qiáng)免疫后，他們發(fā)現(xiàn)RBD-6HB在氫氧化鋁和CPG佐劑存在的情況下能夠刺激小鼠持續(xù)產(chǎn)生高水平的抗體，且RBD-6HB組的抗體滴度高于RBD組（圖2）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，疫苗組小鼠的食量和活動(dòng)情況無明顯差異，表明疫苗的刺激性較小。
 

在小鼠中接種疫苗后的血清抗體反應(yīng)

最后，研究人員還評(píng)估了RBD-6HB疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)作用。他們將新冠病毒注射到hACE2小鼠體內(nèi)。根據(jù)qPCR檢測的結(jié)果，RBD-6HB+佐劑組中SARS-CoV-2的N基因表達(dá)量比6HB組低100倍，比RBD+佐劑組低50倍，這表明候選疫苗具有中和病毒的作用。同樣地，RBD-6HB+佐劑組中SARS-CoV-2的E基因表達(dá)量也低于對(duì)照組，表明候選疫苗可能具有抑制病毒體內(nèi)復(fù)制的作用。

組織學(xué)分析顯示，RBD-6HB組小鼠的肺組織表面被覆一層光滑的漿膜，顯示完整的肺泡結(jié)構(gòu)，無明顯異常，而對(duì)照組則存在炎癥細(xì)胞浸潤，血管充血和肺泡擴(kuò)張（圖3）。這些結(jié)果表明，RBD-6HB疫苗能夠建立有效的保護(hù)屏障，幫助小鼠抵御新冠病毒感染。
 

RBD-6HB疫苗對(duì)hACE2小鼠的保護(hù)

研究結(jié)論
綜上所述，三聚體結(jié)構(gòu)的RBD-6HB蛋白在佐劑存在的情況下能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。RBD-6HB疫苗對(duì)hACE2小鼠具有保護(hù)作用，有效降低了肺部的病毒載量，減少了炎性組織損傷。這項(xiàng)研究突出了RBD結(jié)構(gòu)域在新冠疫苗設(shè)計(jì)中的重要性，為保護(hù)性疫苗的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

原文檢索：
[1] Qu Q, Hao P, Xu W, Li L, Jiang Y, Xu Z, Chen J, Gao Z, Pang Z, Jin N, Li C. A Vaccine of SARS-CoV-2 S Protein RBD Induces Protective Immunity. Int J Mol Sci. 2022 Nov 8;23(22):13716. doi: 10.3390/ijms232213716.