DNA克隆技術(shù)概述及基本步驟

當(dāng)您聽到“克隆”一詞時，您可能會想到克隆整個生物體，例如綿羊多利。然而，克隆某物的全部意思就是制作它的基因精確副本。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，常被克隆的是基因或其他小片段DNA 稱為DNA克隆。

DNA克隆技術(shù)概述
DNA 克隆技術(shù)其實(shí)就是基因編輯，是指制作特定 DNA 片段的多個相同副本的過程。在典型的 DNA 克隆過程中，通常會將目的的基因或其他 DNA 片段插入稱為質(zhì)粒的環(huán)狀 DNA 片段中。插入是使用“剪切和粘貼”DNA 的酶完成的，它會產(chǎn)生一個重組 DNA分子，或由多個來源的片段組裝而成的 DNA。

質(zhì)粒 DNA 的環(huán)狀片段在其末端具有與基因片段相匹配的突出端。質(zhì)粒和基因片段連接在一起，產(chǎn)生含有基因的質(zhì)粒。這種含有基因的質(zhì)粒是重組 DNA 的一個例子，或由多種來源的 DNA 組裝而成的 DNA 分子。

接下來，將重組質(zhì)粒引入細(xì)菌。選擇并培養(yǎng)攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌。當(dāng)它們繁殖時，它們會復(fù)制質(zhì)粒并將其傳遞給它們的后代，從而復(fù)制其中包含的 DNA。

在質(zhì)粒中復(fù)制多個 DNA 序列有什么意義？
在某些情況下，我們需要大量 DNA 拷貝來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或構(gòu)建新的質(zhì)粒。在其他情況下，DNA 片段編碼一種有用的蛋白質(zhì)，細(xì)菌被用作制造蛋白質(zhì)的“工廠”。例如，人類胰島素基因在大腸桿菌中表達(dá)，來制造胰島素。

DNA克隆的基本步驟
1.切開質(zhì)粒并“粘貼”到基因中。這個過程依賴于限制酶（切割 DNA）和 DNA 連接酶（連接 DNA）。
2.將質(zhì)粒插入細(xì)菌。使用抗生素選擇來識別占用質(zhì)粒的細(xì)菌。
3.培養(yǎng)大量攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌，并將它們用作制造蛋白質(zhì)的“工廠”。從細(xì)菌中收獲蛋白質(zhì)并純化。
讓我們仔細(xì)看看每一步。
1. 剪切和粘貼 DNA
不同來源的 DNA 片段如何連接在一起？一種常用的方法使用兩種類型的酶：限制酶和 DNA 連接酶。
限制酶是一種可識別特定的目標(biāo)序列的DNA 切割酶，許多限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生帶有短單鏈懸垂的切割末端。如果兩個分子有匹配的懸垂，它們可以堿基配對并粘在一起。然而，它們不會結(jié)合形成一個完整的 DNA 分子，直到它們被DNA 連接酶連接起來 ，DNA 連接酶密封了 DNA 骨架中的缺口。我們克隆的目標(biāo)是將目標(biāo)基因（例如，人胰島素）插入質(zhì)粒。
   
我們從一個環(huán)形細(xì)菌質(zhì)粒和一個目標(biāo)基因開始。目標(biāo)基因的兩端是限制位點(diǎn)，或特定限制酶識別的 DNA 序列。在質(zhì)粒中，還有一個被同一種酶識別的限制性位點(diǎn)，就在將驅(qū)動細(xì)菌表達(dá)的啟動子之后。
   
質(zhì)粒和靶基因都（分別）用限制酶消化。純化并合并片段。它們具有匹配的“粘性末端”或單鏈 DNA 懸垂，因此它們可以粘在一起。

DNA 連接酶將具有匹配末端的片段連接在一起，形成一個完整的 DNA 分子。這會產(chǎn)生包含目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒。

2. 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與選擇
質(zhì)粒和其他 DNA 可以在稱為轉(zhuǎn)化的過程中引入細(xì)菌，例如實(shí)驗(yàn)室中使用的無害大腸桿菌。在轉(zhuǎn)化過程中，特別準(zhǔn)備的細(xì)菌細(xì)胞會受到?jīng)_擊（如高溫），促使它們吸收外來 DNA。

將通過連接產(chǎn)生的 DNA（可能是所需質(zhì)粒、副產(chǎn)物質(zhì)粒和線性 DNA 片段的混合物）添加到細(xì)菌中。細(xì)菌受到熱休克，這使它們更容易通過轉(zhuǎn)化吸收 DNA。然而，只有極少數(shù)細(xì)菌能成功地?cái)z取質(zhì)粒。
   
質(zhì)粒通常包含抗生素抗性基因，它允許細(xì)菌在特定抗生素存在的情況下存活。因此，可以在含有抗生素的營養(yǎng)平板上選擇吸收質(zhì)粒的細(xì)菌。沒有質(zhì)粒的細(xì)菌會死亡，而攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌可以存活和繁殖。每一個存活下來的細(xì)菌都會產(chǎn)生一個小的、點(diǎn)狀的群體或菌落，它們都是相同的細(xì)菌，它們都攜帶相同的質(zhì)粒。
   
并非所有菌落都必然包含正確的質(zhì)粒。這是因?yàn)�，在連接過程中，DNA 片段并不總是按照我們預(yù)期的方式“粘貼”。相反，我們必須從幾個菌落中收集 DNA，看看每個菌落是否含有正確的質(zhì)粒。限制酶消化和PCR等方法通常用于檢查質(zhì)粒。

3. 蛋白質(zhì)表達(dá)
一旦我們找到了一個帶有正確質(zhì)粒的細(xì)菌菌落，我們就可以培養(yǎng)大量含有質(zhì)粒的細(xì)菌。然后，我們給細(xì)菌一個化學(xué)信號，指示它們制造目標(biāo)蛋白質(zhì)。
   
細(xì)菌充當(dāng)微型“工廠”，大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)。例如，如果我們的質(zhì)粒含有人胰島素基因，細(xì)菌就會開始轉(zhuǎn)錄該基因并翻譯 mRNA 以產(chǎn)生許多人胰島素蛋白質(zhì)分子。
   
選定的菌落在大型培養(yǎng)物（例如 1 升培養(yǎng)瓶）中長大。大型培養(yǎng)物中的細(xì)菌被誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒中包含的基因，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄成 mRNA，然后將 mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)。由該基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)菌內(nèi)部積累。
   
一旦產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，細(xì)菌細(xì)胞就可以裂開釋放出來。除了目標(biāo)蛋白（如胰島素）外，細(xì)菌中還漂浮著許多其他蛋白質(zhì)和大分子。因此，目標(biāo)蛋白必須經(jīng)過純化，或者通過生化技術(shù)從細(xì)胞的其他內(nèi)容物中分離出來。純化的蛋白質(zhì)可用于實(shí)驗(yàn)，或者在胰島素的情況下，可用于患者。

DNA克隆的用途
通過克隆技術(shù)構(gòu)建的 DNA 分子在分子生物學(xué)中有多種用途。主要包括：·
1.生物制藥：
DNA克隆可用于制造具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的人類蛋白質(zhì)，例如上面提到的胰島素。重組蛋白的其他例子包括人類生長激素，用于無法合成激素的患者，以及組織纖溶酶原激活劑 (tPA)，用于預(yù)防血栓。像這樣的重組蛋白通常是在細(xì)菌中產(chǎn)生的。
2.gene therapy：
在某些遺傳病中，患者缺乏特定基因的功能形式。例如，DNA 克隆被用于構(gòu)建含有在囊性纖維化中無功能的正常基因版本的質(zhì)粒。當(dāng)質(zhì)粒被輸送到囊性纖維化患者的肺部時，肺功能惡化的速度減緩.
3.基因分析：
在基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室中，生物學(xué)家經(jīng)常使用 DNA 克隆來構(gòu)建基因的人工重組版本，以幫助他們了解生物體中正�；�因的功能。
     
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