DIA聯(lián)合單細胞技術(shù)揭秘宮頸癌腫瘤微環(huán)境
宮頸癌(CC)是全球女性第三大常見癌癥，人乳頭瘤病毒(HPV)16和18占CC的70%以上。I期CC細胞已經(jīng)從子宮頸表面生長到更深的組織，而II期癌細胞有4厘米或更大，生長在子宮頸和子宮之外，但還沒有擴散到骨盆壁或陰道下部。多組學和單細胞RNA測序技術(shù)的進展對腫瘤微環(huán)境（TME）的特征研究做出了重大貢獻，從而發(fā)現(xiàn)了更多的細胞類型及其對治療的反應(yīng)。然而，目前對不同CC期TME的所有細胞類型進行分析以了解其細胞生物學的研究仍然有限。
2023年1月，佛山市第一人民醫(yī)院劉曉松老師團隊和袁頌華老師團隊于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF 12.658）發(fā)表了題為“Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer“文章，該研究利用snRNA-seq及DIA蛋白質(zhì)組學分析比較了I期和II期CC患者TME內(nèi)的細胞異質(zhì)性和功能，并為開發(fā)診斷CC和治療免疫抑制性TME的新方法奠定了基礎(chǔ)。其中，中科新生命為該研究提供了DIA定量蛋白質(zhì)組學服務(wù)。
研究樣本
I期與II期CC患者的腫瘤組織研究思路
步驟1：鑒定I期和II期宮頸癌的腫瘤細胞組成；步驟2：CCI組與CCII組間的細胞組成差異及細胞群差異表達基因分析；步驟3：DIA定量蛋白質(zhì)組學分析顯示CCII患者存在明顯的免疫抑制。
研究結(jié)果
1. 鑒定I期和II期宮頸癌的腫瘤細胞組成作者首先對I期(n = 4)和II期(n = 3)供體腫瘤組織中分離的所有核（42928個I期和29200個II期）進行了snRNA-seq實驗，并通過聚類分析將所有細胞分類成了22種細胞類型，且在I期和II期CC組中都存在。接著作者通過分析每類細胞群的差異表達基因，并結(jié)合文獻中已標注的標記基因，對細胞群進行注釋。注釋結(jié)果顯示，這22類細胞群與免疫反應(yīng)直接相關(guān)的細胞有T細胞、巨噬細胞（MΦ）、γδT細胞、初始B細胞、成熟B細胞、Treg、NK細胞、CD141+CLEC9A+ DC細胞、pDCs，干細胞類型的有癌癥干細胞(CSCs)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)、血管干細胞(VSCs)、祖細胞，此外還有上皮細胞、淋巴內(nèi)皮細胞、肌成纖維細胞等。
圖1 I期和II期宮頸癌患者腫瘤組織的snRNA-seq分析
2. CCI組與CCII組間的細胞組成差異及細胞群差異表達分析
在得到細胞群的注釋結(jié)果后，作者進一步分析CCI組和CCII組間的細胞組成差異以及細胞亞群的差異表達基因。新的轉(zhuǎn)錄本AC244205.1被發(fā)現(xiàn)是CCII組中多種細胞類型如DCs、MΦs、T細胞、MSCs、NPCs和GMPCs中上調(diào)最多的DEGs之一，提示其可能在CC的進展中發(fā)揮作用。在CCII組多種細胞類型中，與線粒體呼吸機制相關(guān)的DEGs如MT-CYB、MT-CO2、MTCO3、MT-ND1、MT-ND2和MT-ND4的表達均升高，這意味著呼吸鏈上細胞色素的激活，導致了高水平的線粒體生物合成，這可能是由于腫瘤細胞生長在II階段相對于I階段的有顯著的能量消耗，如EMT、“肌生成”、“缺氧”以及snRNA-seq分析表明的多種代謝過程。
CCI患者的MΦs顯示出促炎功能，這表明IFN-α和IFN-γ反應(yīng)信號顯著激活，而CCII患者的MΦs顯示出與細胞生長和組織發(fā)育相關(guān)的許多通路激活，其巨噬細胞主要表型為免疫抑制和促腫瘤生長。IGLL5是CCII組MΦs中隨膠原和線粒體基因上調(diào)的DEG。值得注意的是，MMP11在CCII組的MΦs中幾乎是獨一的。MMP11在CC細胞系和宮頸前病變中過度表達，在乳腺癌中，MMP11的表達被認為是預(yù)后的生物標志物，這意味著類似的MMP11過程可能發(fā)生在CCII組的TME中。此外，CCL19、IL7R、SPARC、MGP、LUM和CXCR4在CCII組的MΦs和各個MΦ亞型中均高表達。
圖2 CCI組和CCII組的MΦs顯示不同的免疫應(yīng)答水平
圖3 CCI組和CCII組巨噬細胞異質(zhì)性分析
實驗結(jié)果中共鑒定出CD8+ T、γδT和Treg三種T細胞群。CCII組CD8+ T細胞的比例(12.85%)明顯高于CCI組(8.58%)，然而盡管CCII組的CD8+ T細胞的數(shù)量明顯更多，但其T細胞具有更強的免疫抑制作用。此外，CCI組的γδT細胞表達了許多干擾素誘導的基因和受體，而Treg和γδT的數(shù)量在CCII組中大幅減少。γδT細胞被發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤生長，γδT細胞數(shù)量的顯著減少可能與II期CC的高度腫瘤發(fā)生有關(guān)。這些結(jié)果表明CCII患者TME中T細胞功能受到抑制。
圖4 CCII組患者的T細胞活性較低
CCI組的pDCs群體更高，而CCII組的B細胞群體更豐富。免疫反應(yīng)，特別是MHC類I通路，在CCI組的DCs和B細胞中更為明顯，而在CCII組的TME中，B細胞和DCs表現(xiàn)出MHC I類抗原的抑制過程。
圖5 CCI組TME中的B細胞和DCs表現(xiàn)出增強的MHC類I通路
NK細胞的數(shù)量分別占CCI和CCII細胞的2.52%和0.85%。與CCI組相比，CCII組NK細胞的比例降低了60%以上，其中許多標志NK細胞功能激活的DEGs上調(diào)，尤其是成熟NK細胞和CD56bright NK細胞。CCI組顯示出顯著的“INF-γ反應(yīng)”和“異體移植排斥反應(yīng)”途徑的高度激活。CCII組中最豐富的通路與細胞組織和組織發(fā)育有關(guān)，可能與更活躍的腫瘤生長有關(guān)。這對NK發(fā)育的二階段NK細胞尤其顯著，EMT通路的明顯激活主要歸因于CCII組FBN1、FN1、SERPINE1、VCAN等多種膠原蛋白的上調(diào)。因此，作者推測NK細胞中膠原的高豐度可能是對II期CC的TME中極低NK細胞數(shù)量的響應(yīng)，以招募更多活性NK細胞。
圖6 CCII患者TME中NK細胞功能受到抑制
在CCI組和CCII組中，與腫瘤進展相關(guān)的其他幾種細胞類型，包括干細胞和上皮細胞，被確定為最高的種群。在CCI組的幾種干細胞類型中，免疫反應(yīng)相關(guān)通路普遍富集，而在CCII組中，細胞和組織生長以及代謝通路高度激活。
圖7 腫瘤相關(guān)干細胞(TASCs)和上皮細胞在CCI患者的TME中更具有免疫反應(yīng)活性
3. DIA定量蛋白質(zhì)組學分析顯示CCII患者存在明顯的免疫抑制
對CCI和CCII組進行DIA定量蛋白質(zhì)組學檢測，共鑒定出6181個蛋白質(zhì)組。此外，作者根據(jù)DEPs和DEGs的FC值評估蛋白質(zhì)譜與細胞類型之間的相關(guān)性，總的來說，相對于CCI患者，CCII患者形成了更強的免疫抑制TME。
GSEA分析顯示，CCI組IFN-α和γ反應(yīng)的激活與通過snRNA-seq分析得到的結(jié)果一致，特別是在免疫細胞類型中。CCII組DEPs上調(diào)與細胞外基質(zhì)、細胞和組織發(fā)育及代謝密切相關(guān)，提示腫瘤發(fā)生程度更高。AKT1是相互作用程度最高的節(jié)點DEP。FN1是CCII組中與其他多個DEP相互作用上調(diào)最多的DEP，研究表明FN1通過激活FAK信號通路促進CC的發(fā)生。在CCI組DEPs上調(diào)方面，有一大群相互作用強烈的組蛋白，包括H2A/H2B和H4成員，它們在轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。作者發(fā)現(xiàn)組蛋白基因可以作為CC患者生存預(yù)測的獨立預(yù)后因素，包括本研究中檢測到的HIST1H4A、HIST1H4E和HIST1H4K。這表明其他組蛋白也可以作為標志物，聯(lián)合CCI組中上調(diào)的其他DEPs，如HSPs和干擾素反應(yīng)相關(guān)蛋白，可用于早期發(fā)現(xiàn)CC。
圖8 CCI (n = 3)和CCII (n = 3)患者腫瘤組織的定量蛋白質(zhì)組學比較
小編小結(jié)
本研究通過使用snRNA-seq和DIA定量蛋白質(zhì)組學，比較研究了I期和II期CC患者的TME。實驗結(jié)果表明，II期CC患者幾乎所有免疫細胞（包括MΦs、T細胞、B細胞、NK細胞和樹突狀細胞）的異質(zhì)性都在很大程度上被調(diào)節(jié)，其表型明顯具有免疫抑制作用。相比之下，這些細胞在I期CC患者中表現(xiàn)出增強的免疫反應(yīng)，其中INF-α和γ反應(yīng)是最激活的信號通路。此外，一些組蛋白顯示出早期診斷CC的潛力。值得注意的是，對于II期CC患者，多種細胞類型的snRNA-seq分析和蛋白質(zhì)組學分析分別鑒定出膠原蛋白的顯著上調(diào)，提示它們可能被用作預(yù)后標志物。另外，本研究首次揭示了新型轉(zhuǎn)錄本AC244205.1的異常表達與II期CC的相關(guān)性。綜上，這些發(fā)現(xiàn)為CC的臨床診斷和免疫治療提供了重要線索。
