siRNA小干擾RNA轉(zhuǎn)染實驗操作流程介紹及要點

siRNA（小干擾RNA）是一種新型的基因治療工具，是由21-25個核苷酸組成的雙鏈短RNA分子，能夠特異性地誘導(dǎo)靶基因的沉默，進而抑制蛋白的表達。siRNA最初由Andrew Fire和Craig Melo在1998年提出，之后在2001年被證明可以特異性地抑制哺乳動物細(xì)胞中的靶基因表達。這一發(fā)現(xiàn)由David Baulcombe團隊在《科學(xué)》雜志上發(fā)表，成為當(dāng)年全球十大科學(xué)進展之首，他的團隊并于2006年榮膺了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

siRNA的抑制作用是通過其與AGO蛋白組裝成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）發(fā)揮的。一條鏈被降解，另一條鏈則與靶基因的mRNA互補配對，使其被切割降解，從而達到治療相關(guān)疾病的目的。與傳統(tǒng)的基因治療相比，siRNA具有高度特異性、快速、可逆性等優(yōu)點，可以應(yīng)用于各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用。例如siRNA靶向惡性腫瘤的基因可以通過局部或系統(tǒng)性給藥來治療腫瘤，病毒感染和遺傳疾病也都有涉及。
 

siRNA 抑制蛋白表達機制

為了方便使用，常規(guī)siRNA產(chǎn)品以凍干粉形式提供，可以直接用于各種細(xì)胞RNAi實驗�？蒲腥藛T可以根據(jù)需要設(shè)計特定靶點，覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因。同時，通過對siRNA進行化學(xué)修飾，可以提高其在體內(nèi)實驗中的高效性、特異性和穩(wěn)定性。

RNA干擾（RNAi）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程，常常被用作基因沉默（基因干擾）的工具之一。siRNA作為RNAi的一種形式，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。未來，siRNA還將繼續(xù)發(fā)揮其獨特的優(yōu)勢，成為治療相關(guān)疾病的新趨勢。

siRNA轉(zhuǎn)染實驗介紹
01- siRNA儲存
常規(guī)化學(xué)合成的siRNA序列為21～23nt的雙鏈小分子RNA，為凍干粉形式的即用型試劑 ，在常溫不溶解的情況下可以保存至少1個月時間，放置于-20℃～-80℃低溫環(huán)境中，凍干粉可以穩(wěn)定保存一年。

02- 轉(zhuǎn)染試劑儲存
4℃保存，不可冷凍。

03-體外轉(zhuǎn)染操作流程：
第一步、接種細(xì)胞：建議提前一天接種細(xì)胞，接種數(shù)量參考下方推薦量。

第二步、 轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制：
● siRNA稀釋液配制：siRNA以水稀釋至140 μg/mL。
● siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制：取無菌離心管，加入2μL siRNA稀釋液，加入Lipidnano^TM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑A液14μL，吹打混勻，加入Lipidnano^TM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑B液4μL，混合均勻，室溫放置5min，加培養(yǎng)液180μL，吹打混勻。

第三步、細(xì)胞加樣：按下方推薦量將配制好的siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液加入各細(xì)胞孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。

第四步、細(xì)胞培養(yǎng)：37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至發(fā)揮干擾作用。建議24~48h測定mRNA水平、48~72h測定蛋白水平。
 

操作流程示例

siRNA樣品加入示例

注：使用本轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞進行siRNA轉(zhuǎn)染時，為了獲得最佳基因沉默效果，每一種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siRNA的劑量都需要經(jīng)過實驗確定最佳范圍。

示例中使用的體外轉(zhuǎn)染試劑為同立海源生產(chǎn)的Lipidnano^TM Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑，主要應(yīng)用于：貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染，部分原代細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)染，siRNA高通量轉(zhuǎn)染試驗。在進行體外轉(zhuǎn)染實驗的過程中，實驗還需注意這些細(xì)節(jié)：

❶ 轉(zhuǎn)染前，確保siRNA是經(jīng)過PAGE純化和脫鹽處理過的，高純度的siRNA或者miRNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，并確保 siRNA/miRNA 基因沉默表達不會影響細(xì)胞活力。

❷ 首次轉(zhuǎn)染：如果您是首次轉(zhuǎn)染您的細(xì)胞系，推薦嘗試使用幾個siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合液濃度，并在0.014μg/mL~0.70μg/mL范圍內(nèi)改變siRNA的濃度，根據(jù)首次轉(zhuǎn)染結(jié)果調(diào)整劑量水平。

❸ siRNA轉(zhuǎn)染試劑稀釋液的選擇：對培養(yǎng)基無特殊要求，可使用完全培養(yǎng)基進行稀釋，不強要求減/無血清培養(yǎng)基。

❹ 濃度換算：摩爾濃度與質(zhì)量濃度之間的換算關(guān)系可根據(jù)siRNA分子量可進行同步換算。X nmol/L*分子量=Y ng/L，如分子量為14000的siRNA，1nmol/L*14000=14000ng/L=14μg/L。

❺ 轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度：推薦在70％左右時進行轉(zhuǎn)染。通常基因沉默的分析要在轉(zhuǎn)染后24小時進行。本轉(zhuǎn)染試劑極低的細(xì)胞毒性可以方便研究者根據(jù)目的細(xì)胞生長特性，靶基因的表達特性，選擇適合條件進行轉(zhuǎn)染。健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性。通常健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。推薦用50代以下的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

❻ 陽性對照選擇：通過合適的陽性對照、實驗siRNA優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件，對大多數(shù)細(xì)胞，GADPH-siRNA是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照siRNA或?qū)嶒瀞iRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后，以內(nèi)參基因如β-actin mRNA為對照，統(tǒng)計目標(biāo)mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。

傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑可通過表面正電荷幫助siRNA大量攝取入胞，但入胞后siRNA內(nèi)含體逃逸水平低，造成攝取的siRNA無法發(fā)揮作用，同時造成細(xì)胞毒性。本品為非強正電性脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，避免細(xì)胞大量攝取造成的毒性，但本品可提升細(xì)胞內(nèi)吞后的siRNA內(nèi)含體逃逸效率，通過促進內(nèi)含體逃逸使更多siRNA釋放入細(xì)胞質(zhì)中實現(xiàn)高效基因沉默作用。故在細(xì)胞水平上通過熒光標(biāo)記siRNA進行條件優(yōu)化的方法不適用于本轉(zhuǎn)染試劑。推薦使用Western Blot或QPCR方式對最佳轉(zhuǎn)染濃度進行優(yōu)化。

❼ 操作注意：siRNA與轉(zhuǎn)染試劑A液實現(xiàn)充分混合后加入B液，繼續(xù)混合均勻，放置5min后加入培養(yǎng)基稀釋，稀釋后需在1h內(nèi)加入細(xì)胞孔內(nèi)。將siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合液加至每一個包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，加入后可以輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。

❽ 避免RNA酶污染：微量RNA酶會導(dǎo)致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚、頭發(fā)、所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品。因此請確保實驗每個步驟不受RNA酶污染。推薦使用商業(yè)化無酶實驗耗材。

❾ 效果評價：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，不同細(xì)胞和siRNA效率存在差異。在mRNA水平觀察siRNA效果的最佳時間是轉(zhuǎn)染后24~48小時，在蛋白水平觀察siRNA效果的最佳時間是轉(zhuǎn)染后48~72小時。siRNA干擾是非線性的，不同基因半衰期存在較大差異，首次進行siRNA干擾效果測定時，建議多點測定，確定最佳測定時間點。

siRNA沉默效果分析